研究背景和目的下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma,HSCC)是头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)中恶性程度较高的一种。该肿瘤具有早期诊断困难、分化差、易发生粘膜下扩散及淋巴结转移等特点,因此,患者预后极差,5年生存率仅为20-40%。手术联合放、化疗是目前该疾病的主要治疗手段。虽然以顺铂为基础药物的化疗方案在保留患者喉功能以及延长患者生存时间等方面具有一定的作用,但是敏感性差且易产生耐药性仍然是该肿瘤化疗的一大瓶颈。因此,寻找改善下咽鳞状细胞癌化疗敏感性的药物或方法,可能是提高该疾病治疗水平的一种途径。髓细胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白是B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族中重要的抗凋亡成员之一。Mcl-1在头颈部鳞状细胞癌中的高表达状态,与肿瘤细胞的生存维持以及放、化疗抵抗性等密切相关。研究表明,某些药物或其他因素诱导头颈部鳞状细胞癌细胞发生凋亡的机制与Mcl-1的表达下调或功能受抑制密切相关。而且,通过反义RNA技术等降低Mcl-1的表达,可以提高头颈部鳞状细胞癌细胞对顺铂、5-FU等药物的敏感性。上述研究提示我们,可以将靶向Mcl-1的药物或方法引入到下咽鳞状细胞癌的治疗中。近年来,学者们创新性提出,可以通过寻找抑制Mcl-1转录的方法来降低其表达。RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraselⅡ,RNAPⅡ)在Mcl-1等基因转录启动及延伸的过程中发挥着重要作用。而RNP Ⅱ的活化需要受到上游多个分子的调控,其中正向转录延伸因子 b(The positive transcriptional elongation factor b,p-TEFb)磷酸化RNPⅡ羧基末端结构域内七肽重复序列中的第二位丝氨酸(phospho-RNAP Ⅱser2,p-RNAP Ⅱs2)是十分关键的一步。通过 p-RNAP Ⅱs2,RNAPⅡ能够有效地促进RNA延伸。在p-TEFb的组成成分中,细胞周期依赖性激酶9/周期蛋白 T(cyclin-dependent kinase 9/cyclin T,CDK9/cyclin T)是磷酸化 RNAPⅡ的核心亚基。因此,学者们提出,可以通过抑制CDK9来降低Mcl-1等基因的转录及表达。近十几年以来,学者们已研发出多种CDK9抑制剂,其中南澳大学Shudong Wang教授团队合成的CDKI-73是目前活性最强的CDK9抑制剂之一(抑制常数Ki=3nM)。与其他CDK9抑制剂相比,CDKI-73具有对正常细胞毒性小、靶向性强等优势。在对慢性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病及卵巢癌治疗作用的评价中,CDKI-73显示了良好的杀伤肿瘤细胞的能力,但对正常细胞的毒性很小。目前,该化合物正处于申报澳大利亚及国内一期临床试验阶段,具有良好的应用前景。在本研究中,我们发现下咽鳞状细胞癌组织中Mcl-1呈转录活跃的状态,且其mRNA表达水平与肿瘤的大小相关,这提示我们,与头颈部鳞状细胞癌一致,Mcl-1可能也是维持下咽鳞状细胞癌细胞生存并导致其对顺铂不敏感的一个因素。据此,我们推测,CDK9抑制剂在抑制下咽鳞状细胞癌的细胞生长及增强其化疗敏感性方面可能具有一定的作用。而目前尚无关于CDK9抑制剂在下咽鳞状细胞癌中治疗作用的报道。因此,我们继续通过体外实验评估了 CDKI-73对下咽鳞状细胞癌细胞生长及化疗敏感性的影响,并对相关机制进行了初步的探索,以期为下咽鳞状细胞癌的临床治疗提供新的候选药物。研究目的1.通过对下咽鳞状细胞癌中Mcl-1转录水平的检测,明确CDKI-73在下咽鳞状细胞癌治疗中潜在的应用价值;2.研究CDKI-73对下咽鳞状细胞癌细胞生长的影响及其相关机制;3.探索CDKI-73能否增强下咽鳞状细胞癌细胞对顺铂的敏感性。研究方法和结果1.与癌旁正常粘膜组织相比,下咽鳞状细胞癌组织中Mcl-1在mRNA水平上呈高表达状态为检测Mcl-1在下咽鳞状细胞癌组织中的转录情况,我们收集了 57例下咽鳞状细胞癌患者的肿瘤组织标本及31例癌旁正常粘膜组织标本。运用Real-time PCR技术,对上述组织标本中Mcl-1 mRNA的表达水平进行了检测。结果显示,与癌旁正常粘膜组织相比,起源于·梨状窝(36例)、喉咽后壁(13例)及环后区(8例)的下咽鳞状细胞癌组织中Mcl-1在mRNA水平上均表达上调(p<0.01)。由此可知,Mcl-1基因在下咽鳞状细胞癌中转录活跃。我们进一步分析了肿瘤组织中Mcl-1 mRNA的表达水平与患者临床特征之间的关系,发现Mcl-1 mRNA的表达水平与肿瘤大小(p = 0.01)及患者的临床分期(p = 0.017)密切相关。在体积较大(最大径超过2cm)或临床分期(Ⅲ-Ⅳ期)较晚的患者的肿瘤组织中,Mcl-1 mRNA的表达水平显著上调,提示在下咽鳞状细胞癌中,Mcl-1可能具有维持肿瘤细胞生存的作用。2.CDKI-73具有抑制FaDu细胞增殖的作用研究显示,CDK9抑制剂对Mcl-1高表达的肿瘤具有良好的抗增殖作用。因此,我们进一步探索了 CDKI-73对人下咽鳞状细胞癌细胞系——FaDu细胞的体外药理作用。在正常培养条件下,用不同浓度的CDKI-73分别处理FaDu细胞和HEK293细胞(即人胚肾细胞)。24小时及48小时后,利用CCK8(Cell Counting Kit-8,CCK8)实验检测细胞存活率。实验结果显示,随着药物浓度增加或者药物作用时间延长,FaDu细胞的细胞存活率逐渐下降。而在相同的条件下,HEK293细胞存活率的下降程度均明显低于FaDu细胞(p<0.05或p<0.01)。CDKI-73作用24小时及48小时,FaDu细胞及HEK293细胞的IC50分别为5.77± 2.87μM vs.66.96 ± 25.66 μM(24 小时,p= 0.01)、0.86 ±0.33 μM vs.8.82 ±4.64 μM(48小时,p<0.01)。由此可见,CDKI-73对FaDu细胞的增殖具有显著的抑制作用,且与正常细胞相比,CDKI-73对FaDu细胞的抑制作用更强。3.CDKI-73通过诱导凋亡及阻滞细胞周期来抑制FaDu细胞的增殖接下来,我们首先观察了 CDKI-73是否通过诱导凋亡来抑制FaDu细胞的增殖。Caspase-3活性检测实验显示,caspase-3的活化程度随CDKI-73浓度的递增而显著升高。而且,作为caspase-3的剪切对象,多腺苷二磷酸多聚酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)被剪切程度也随CDKI-73浓度的升高而增强。同时,我们通过Annexin V-FITC/PI双染法凋亡检测实验,发现升高CDKI-73的浓度或者延长CDKI-73的作用时间,均可引起FaDu细胞凋亡比率的增加,且在相同的处理条件下,FaDu细胞凋亡比率与CCK8实验结果相近。以上结果均提示,CDKI-73主要通过诱导FaDu细胞凋亡来抑制其增殖。同样地,在人咽癌胸水转移细胞系——Detroit 562细胞系中,CDKI-73也呈剂量依赖性地激活caspase-3,并且呈时间-剂量依赖性地增加凋亡细胞比率,进一步证实了 CDKI-73对咽部恶性肿瘤细胞的促凋亡作用。其次,我们探索了 CDKI-73是否可以阻碍FaDu细胞的细胞周期进而影响其增殖。利用细胞周期检测实验,我们发现,与0μM相比,低浓度(0.25 μM)的CDKI-73可以显著地提高G0/G1期细胞比率(65.18±3.12%vs 46.13±2.22%,p<0.01),而降低 S 期细胞比率(25.29±3.16%vs.46.11 ±2.54%,p<0.01)。因此,我们认为CDK丨-73还可以通过阻滞FaDu细胞周期进程来抑制其增殖。4.CDKI-73 在 FaDu 细胞中的作用模式(Mode of action,MoA)进一步,我们对CDKI-73在FaDu细胞中的作用机制进行了探索。我们用不同浓度的CDKI-73处理FaDu细胞。24小时后,通过Western blot的方法对CDK9及其下游分子的磷酸化、表达情况进行了检测。实验结果显示,随着CDKI-73浓度的增加,CDK9磷酸化受到明显的抑制,相应地,其下游的RNAP Ⅱ的磷酸——p-RNAP Ⅱs2也被显著减弱。而p-RNAP Ⅱs2是CDK9的生物活性标志物,因此上述结果提示CDKI-73能够抑制CDK9的功能。另外,上述处理也显著降低了 FaDu细胞中Mcl-1蛋白的表达水平。进一步,我们观察了 CDKI-73是否通过影响Mcl-1的转录而降低Mcl-1的表达。用不同浓度的CDKI-73处理FaDu细胞12小时,Real-time PCR实验显示,RNAP Ⅱ下游的三个基因——Mcl-1、Bcl-2及 X 连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的 mRNA 表达水平呈剂量依赖性地降低,其中Mcl-1 mRNA降低程度最为显著,其次为Bcl-2 mRNA。上述发现,在Detroit 562细胞中也得到了验证。由此可见,CDKI-73可以通过抑制CDK9、RNAP Ⅱ,进而降低下游Mcl-1等基因的转录和表达。为明确Mcl-1对CDKI-73的抑制作用更加敏感,我们给予FaDu细胞低剂量(0.5 μM)的CDKI-73,并在给药后不同的时间点比较了 Mcl-1和Bcl-2两个基因的转录情况,发现Mcl-1 mRNA的表达水平较Bcl-2降低地更加迅速(p<0.01)。由此可知,在下咽鳞状细胞癌细胞中,Mcl-1对CDKI-73的抑制作用更加敏感。5.CDKI-73的作用模式可能是其诱导FaDu细胞凋亡的机制为明确CDK9是否为CDKI-73诱导FaDu细胞凋亡的靶点,我们将CDK9的小干扰RNA(分别标记为S1和S2)及无关序列对照(scrambled nucleotide,SN)分别转染进入FaDu细胞,以观察干扰CDK9的表达对FaDu细胞的影响。Western blot及Real-time PCR结果显示,干扰CDK9的表达能够抑制RNAP Ⅱ丨的磷酸化、Mcl-1的转录及表达,进一步证实了 CDKI-73是通过抑制CDK9来降低Mcl-1的转录和表达。更重要的是,Annexin V-FITC/PI双染法凋亡检测实验结果显示,干扰CDK9的表达可以引起FaDu细胞凋亡比率的增加(S1 v.SN,19.69±4.09%vs.9.49±2.53%,p<0.05;S2 vs.SN,22.25 ±3.41%vs.9.49±2.53%,p<0.05),说明了 CDK9很可能是CDKI-73发挥促凋亡作用的靶点。另有研究证实,降低Mcl-1的表达或抑制其功能均可以诱导FaDu细胞凋亡。因此,通过抑制CDK9,进而降低Mcl-1的表达,很可能是CDKI-73诱导FaDu细胞凋亡的机制。6.CDKI-73能够增强FaDu细胞对顺铂的敏感性Mcl-1的高表达是影响头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性的重要因素。而CDKI-73能够有效降低FaDu细胞中Mcl-1转录及表达,因此,我们进一步探索了 CDKI-73能否增强FaDu细胞对顺铂的敏感性。联合指数(Combination Index,CI)是评价两种药物联用时药物之间相互作用关系的重要方法。CI>1,表示两药具有拮抗作用;CI<1,表示两药具有协同作用;而CI=1,表示两药仅有相加作用。据此,我们通过计算CI以评价CDKI-73与顺铂的关系。我们选取了一个能够显著降低FaDu细胞中Mcl-1表达但不会引起过多细胞凋亡的浓度,即0.25 μM。用不同浓度的顺铂单独或者与0.25 μM CDKI-73联合处理FaDu细胞。48小时后,利用CCK8实验,我们获得了 CDKI-73、顺铂单用及两药联合情况下的细胞增殖抑制率,并将数据输入专门用于计算CI的软件——CompuSyn program。计算结果显示,0.25 μM CDKI-73与不同浓度顺铂联用的CI均小于1,提示CDKI-73和顺铂在抗FaDu细胞增殖方面具有协同作用,也说明CDKI-73在改善FaDu细胞对顺铂的敏感性方面具有一定作用。另外,我们用Annexin V-FITC/PI双染法,对0.25 μM CDKI-73、1 μM顺铂单用或两药联用情况下的细胞凋亡比率进行了检测和比较。结果显示,CDKI-73与顺铂联合运用对FaDu细胞的诱导凋亡作用(54.4 ± 8.3%)显著强于CDKI-73(20.6 ± 3.0%,p<0.01)及顺铂(24.7± 5.9%,p<0.01)单药运用,进一步验证了两种药物的协同作用。研究结论1.Mcl-1在下咽鳞状细胞癌中存在转录活跃的现象,而且肿瘤组织中Mcl-1 mRNA的表达水平与患者的肿瘤大小及临床分期密切相关。该现象提示,Mcl-1可能在下咽鳞状细胞癌细胞的生存维持及化疗不敏感性等方面中具有一定作用,且CDK9抑制剂可能对下咽鳞状细胞癌的治疗具有一定的应用价值。2.CDKI-73具有选择性抑制FaDu细胞增殖的功能,且主要通过诱导FaDu细胞凋亡的途径。其次,阻滞细胞周期也有助于CDKI-73抑制FaDu细胞的增殖。由此可见,CDKI-73单药可能对下咽鳞状细胞癌具有治疗作用。3.通过抑制CDK9,进而降低Mcl-1的转录和表达,很可能是CDKI-73诱导FaDu细胞发生凋亡的机制。4.体外实验证实,在抑制FaDu细胞增殖方面,CDKI-73和顺铂具有协同作用,提示CDKI-73能够增加下咽鳞状细胞癌细胞对顺铂的敏感性。