背景与目的:四肽重复序列干扰素诱导蛋白2（Interferon-Induced protein with Tetratricopeptide repeats 2,IFIT2）过表达导致肿瘤患者生存期延长,缺失IFIT2基因会导致细胞上皮间质转化、促进细胞迁移和浸润。本人前期研究发现抑制IFIT2蛋白泛素化降解会导致IFIT2在中心体定位,推测IFIT2中心体定位可能影响到中心体的功能,继而影响细胞分裂、凋亡以及肿瘤转移等。本研究旨在阐明IFIT2泛素化降解与其中心体定位在肿瘤细胞内的关系及其机制,并探讨IFIT2中心体定位作为肿瘤治疗靶点的可能性。材料与方法:1、确定泛素-蛋白酶体途径对IFIT2中心体定位的影响:构建IFIT2表达质粒p IRES-EGFP-IFIT2和p EGFP-IFIT2,并转染到293T细胞,使用蛋白酶体抑制剂及蛋白泛素抑制剂处理细胞,通过免疫荧光检测IFIT2与γ-tubulin蛋白定位情况,进一步采用动态荧光显微镜观察抑制泛素化和蛋白降解后IFIT2在细胞内运动情况,蛋白质免疫共沉淀技术检测IFIT2泛素化情况及与γ-tubulin蛋白的相互作用情况。2、确定IFIT2泛素化降解的机制:构建K63R突变体表达质粒,转染到293T细胞,用来筛选IFIT2泛素化位点,从而确定其与IFIT2中心体定位的关系;采用分子克隆、RNA干扰、过表达等分子生物学技术验证可能的E3连接酶对IFIT2泛素化、稳定性的影响。3、IFIT2相互作用蛋白的鉴定与分析:建立以链霉素和S蛋白双免疫沉淀体系,进而通过质谱分析获得相互作用的蛋白并分析其作用;构建5个截断型IFIT2蛋白突变体,通过免疫印迹法（Western Blot,WB）和荧光分析了不同突变体在细胞内定位和分子量,从而研究蛋白结构域对IFIT2相互作用及功能的影响;通过WB分析了质谱鉴定结果,进一步验证IFIT2相互作用蛋白。结果:1.IFIT2中心体定位的作用,泛素化位点和作用机制1.1 IFIT2聚集蛋白酶体抑制剂处理细胞后,IFIT2蛋白在细胞中增多,泛素化水平明显升高,表明泛素-蛋白酶体途径参与了IFIT家族蛋白降解。抑制蛋白降解途径可以导致IFIT2增加,并促使IFIT2聚集。1.2免疫荧光分析IFIT2聚集小体的亚细胞定位,结果显示:单个IFIT2小体可以聚集在细胞核周边,分裂中期细胞中发现两个小体可对称分布于分裂中期细胞的赤道板两侧。蛋白质免疫共沉淀技术发现MG132处理细胞后,IFIT2能与γ-tubulin蛋白相互作用,而未经MG132处理时,IFIT2不能与γ-tubulin蛋白相互作用。以上结果表明:泛素-蛋白酶体途径参与IFIT2中心体定位调节。1.3将转染EGFP–IFIT2的293T细胞与不同浓度的秋水仙碱预孵育后用MG132再处理。数据显示,随着秋水仙碱浓度的增加,IFIT2在中心体中的聚集显著减少,表明IFIT2向中心体的聚集依赖于微管运输。将转染EGFP–IFIT2的293T细胞与不同剂量的Ciliobrevin D孵育,然后用MG132处理,结果表明Ciliobrevin D以剂量依赖性的方式减少蛋白酶体抑制剂介导的IFIT2聚集。提示IFIT2向中心体聚集依赖于微管运输系统。1.4构建K63R突变体,将k63野生型和K63R突变的泛素与IFIT2共同转染到293T细胞中,加入蛋白酶体抑制剂抑制IFIT2蛋白降解,分析k63突变对IFIT2定位的影响。结果显示,不转染泛素（Ubiquitin,Ub）分子时,IFIT2蛋白弥散分布在胞浆中;当IFIT2和野生型泛素共转染时,IFIT2有部分聚集在中心体上,当IFIT2和K63R突变体共转染时,IFIT2在中心体中聚集呈增大,而胞浆中的IFIT2含量明显减少。统计学分析发现K63R突变后IFIT2聚集体直径明显缩小。以上结果表明IFIT2中心体聚集依赖于K63泛素化。1.5经IFIT2转染293T细胞,然后用MG132（蛋白酶体抑制剂）、MLN4924（Neddylation抑制剂）处理细胞24h,结果显示MG132和MLN4924都能导致IFIT2升高。表明泛素化修饰和Neddylation都参与了IFIT2的泛素化降解。MLN4924作为Neddylation的抑制剂可以抑制蛋白神经前体表达发育下调蛋白8（Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8,NEDD8）修饰。分析MLN4924对全反式维甲酸（All-trans-retinoicacid,ATRA）诱导IFIT2表达的影响,结果显示抑制NEDD8修饰可增强ATRA诱导IFIT2表达。进一步分析在抑制蛋白合成的基础上,观察MLN4924对IFIT2降解速度的影响。结果显示,单独用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理细胞对细胞中Cullin1蛋白的NEDD8修饰影响较小,而MLN4924处理2个h就检测不到NEDD8的修饰,抑制Neddylation可以明显减慢IFIT2的降解。这一结果表明NEDD8修饰参与了IFIT2的泛素化降解。1.6构建针对NEDD8,NAE1,Cullin1等sh RNA表达质粒,通过对其干扰效果的验证,除了NAE1的沉默效果较差外,能有效沉默NEDD8、cullin1和cullin3。结果显示Cullin1和Cullin3的抑制效果最明显。沉默CULLIN1,结果显示,抑制Cullin1明显可以上调IFIT2蛋白,表明以Cullin1为支架的CRL-1E3连接酶可能调控IFIT2的蛋白的降解。1.7分析了MLN4924对APL分化的影响,结果显示MLN4924可以抑制Cullin蛋白NEDD8修饰。细胞水平上发现抑制Neddylation可以抑制急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）细胞NB4的增殖,诱导细胞凋亡,细胞周期阻滞在S期。进一步分析了MLN4924联合ATRA对APL细胞分化的影响。结果显示,MLN4924可以诱导NB4细胞表达CD11B,形态上增强ATRA诱导的细胞分化。同时,分子水平上发现MLN4924可以上调死亡诱导蛋白激酶1（Death-associated protein kinase 1,DAPK1）表达,促进细胞自噬分子beclin1蛋白表达和磷酸化,继而导致LC3的剪切,从而引起细胞自噬,最终导致APL细胞分化。2.IFIT2相互作用蛋白以及其参与的信号通路分析2.1成功构建了含有SFB-tag的慢病毒表达质粒载体,构建了N-SFBPLVX-IRES-z SGreen和C-SFB-PLVX-IRES-z SGreen,并保证了质粒的多克隆酶切位点。2.2双免疫沉淀系统分析IFIT2相互作用蛋白:采用两次免疫沉淀的方法,特意的与IFIT2相互作用的蛋白,然后通过质谱分析获得76个相互作用蛋白,通过对其相互作用蛋白进行分析,发现IFIT2相互作用蛋白主要参与髓系细胞活化,COP9信号复合体,m RNA相互作用蛋白,干扰素调控网络等。这些结果表明IFIT2可以通过多种途径参与抗肿瘤作用。2.3 IFIT2与热休克蛋白（Heatshockprotein,HSP）70相互作用:构建5个截断型IFIT2蛋白突变体,通过WB和荧光分析了不同突变体在细胞内定位和分子量。WB结果显示,5个突变体在细胞中都可以表达蛋白;细胞定位结果显示,除了3-9四三肽重复序列（Tetratricopeptide repeat,TPR）结构域缺失的突变体定位在细胞浆和细胞核内外,其它所有的IFIT2突变体都定位在细胞浆中,提示3-4TPR结构域决定了IFIT2胞浆定位。WB分析了质谱鉴定结果。结果显示,IFIT2与HSPA1B相互作用,但是未检测到IFIT2与HSP90a和HSP90b的相互作用。同时,分析了HSPA1B与不同IFIT2突变体之间的相互作用。结果显示,除了3-9TPR缺失的突变体IFIT2-150不能与HSPA1相互作用外,其他突变体都可以与HSPA1相互作用,表明IFIT2胞浆定位对IFIT2与HSPA1B相互非常重要。结论:1、动力蛋白介导的微管运输系统参与蛋白泛素化介导的IFIT2中心体聚集。2、泛素k63修饰IFIT2是导致IFIT2中心体聚集的重要分子基础。3、Neddylation通过调控泛素-E3链接酶Cullin1的活性促进IFIT2蛋白泛素化降解,抑制Neddylation活性可以抑制IFIT2蛋白降解并增加IFIT2抗白血病作用。4、IFIT2通过与COP9信号复合体,m RNA相互作用蛋白,干扰素调控网络等相互作用发生生物学作用。