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甘蓝型油菜属于十字花科,以收获种子为主要目的,是一种重要的油料作物。油菜植株花序的生长与植株的角果数有较大关系,直接影响到油菜种子的产量。此外,油菜的开花期与成熟期相关性较大,而油菜成熟期的提早有利于稻-稻-油三熟制在我国南方地区的推广。TFL1基因是控制拟南芥花序生长和开花时间的重要基因,甘蓝型油菜的BnTFL1基因为拟南芥TFL1基因的同源基因。本实验对甘蓝型油菜BnTFL1基因进行了克隆、表达和功能的研究。甘蓝型油菜的再生培养通常采用以去除子叶节的带柄子叶和下胚轴切段为外植体的二步培养方法,即先将外植体置于预培养基中进行预培养诱导愈伤组织,然后再转到分化培养基中进行分化培养诱导不定芽的生成。二步培养操作较繁琐,不定芽再生周期较长。目前油菜遗传转化以二步培养为基础,操作过程比较繁琐,转化周期较长。本研究创新性地以含子叶节分生组织的带柄子叶和下胚轴为外植体,建立了只需在分化培养基中诱导子叶节分生组织细胞形成不定芽的简单、快速、高频的一步培养体系以及基于一步培养的遗传转化体系。本研究建立的甘蓝型油菜遗传转化体系的优点是简化了操作过程,显著缩短了转化周期。主要研究结果如下：1.在甘蓝型油菜中克隆得到了5个花序生长调节因子基因BnTFL1-1、BnTFL1-2、 BnTFL1-3、BnTFL1-4和BnTFL1-5及各基因相应的cDNA序列BnTFL1-1c、BnTFL1-2c、 BnTFL1-3c、BnTFL1-4c和BnTFL1-5c。生物信息学分析发现,BnTFL1-1c、 BnTFL1-2c、 BnTFL1-3c、BnTFL1-4c和BnTFL1-5c编码蛋白均具有PEBP结构域,为非跨膜亲水蛋白,位于细胞质中。进化树分析结果表明,5个BnTFL1基因与其他植物的TFL1基因有较高的同源性。5个BnTFL1基因与拟南芥的TFLl基因亲缘关系较近,其中BnTFL1-4和BnTFL1-5与TFL1的亲缘关系最近,BnTFL1-2次之, BnTFL1-1和BnTFL1-3与TFL1的亲缘关系最远,表明BnTFL1-1和BnTFL1-3的进化程度较高,BnTFL1-2进化程度中等,BnTFL1-4和BnTFL1-5的进化程度较低。2.对5个BnTFL1基因在不同生长发育阶段的甘蓝型油菜不同组织／器官中的表达情况进行了分析,发现BnTFL1基因主要在茎尖、花和花蕾中表达。其中,BnTFL1基因在花芽分化期的茎尖中表达活性最强,在营养生长期的茎尖和抽薹现蕾初期的幼蕾中表达活性较强,在盛花期的花朵和花蕾中的表达活性则很弱。5个BnTFL1基因在同一组织／器官中的表达情况并不相同,BnTFL1-4和BnTFL1-5表达活性较强,BnTFL1-1、 BnTFL1-2和BnTFL1-3表达活性较弱。3.克隆了BnTFL1-1基因的启动子BnTFL1-1-promoter和BnTFL1-3基因的启动子BnTFL1-3-promoter。应用PlantCARE分析发现,BnTFL1-1-promoter和BnTFL1-3-promoter中包含大量光反应元件,表明BnTFL1-1-promoter和BnTFL1-3-promoter属于光诱导型启动子,主要参与光信号诱导的开花调控。此外,BnTFL1-1-promoter和BnTFL1-3-promoter中还含有胚乳表达作用元件和植物胁迫相关的一些元件,表明BnTFL1-1-promoter和BnTFL1-3-promoter还可能与油菜的胚乳发育、抗病、抗逆等功能有关。4.获得了BnTFL1-1c基因转基因拟南芥植株,T1代转基因拟南芥植株抽薹、开花和成熟明显比野生型晚,株高明显比野生型高,分枝数明显比野生型少,角果数明显比野生型少,但主枝角果数与野生型差异不大。表明BnTFL1-1基因的主要功能是延迟植株的开花和成熟时间,促进植株的营养生长和花序的生长,减少植株的分枝数量。BnTFL1-1基因的主要功能与拟南芥TFL1基因大体相同,不同的是,BnTFL1-1基因抑制植株的分枝,而TFZ1基因促进植株的分枝。5.获得了5株转BnTFL1基因RNAi油菜植株TY1、TY2、TY3、TY4和TY5。与非转基因植株相比,转基因植株TY1、TY2、TY3和TY4抽薹、现蕾、开花和成熟明显要早,株高明显要矮,分枝明显增多。表明BnTFLl基因的主要功能是推迟油菜植株的开花和成熟时间,促进油菜植株的营养生长和花序的生长,减少油菜植株的分枝数量。这与BnTFL1-1c在拟南芥中的功能表现一致。6.通过采用BnTFL1基因RNAi技术,获得了开花期和成熟期均比野生型植株提早的转基因油菜植株,为通过生物技术进行油菜遗传改良,快速获得早熟油菜种质资源材料开拓了一条新途径。7.建立了以甘蓝型油菜含子叶节分生组织的下胚轴为外植体的一步培养技术体系。该技术体系为,切取5d苗龄中双11号含子叶节分生组织的下胚轴置于MS+ 4.0mg/L 6-BA+30g/L sucrose+2.6g/L phytagel培养基中培养,5d再生出不定芽,再生频率为100%,平均每个外植体再生出8.0个不定芽。在此基础上,建立了甘蓝型油菜的遗传转化体系,成功将BnTFLl基因RNAi重组载体转入中双11号中。整个转化周期从播种到得到生根抗性苗仅需大约70 d,而基于甘蓝型油菜下胚轴二步培养的遗传转化方法整个转化周期需要130 d左右,大大缩短了转化周期,简化了转化过程,提高了转化效率。8.建立了以甘蓝型油菜含子叶节分生组织的带柄子叶为外植体的一步再生培养技术体系。该技术体系为,切取5d苗龄中双11号含子叶节分生组织的带柄子叶置于MS+3.0mg/L 6-BA+30g／L sucrose+2.6g／L phytagel培养基中培养,5d再生出不定芽,再生频率为100%,平均每个外植体再生出5.5个不定芽。在此基础上,建立了甘蓝型油菜的遗传转化体系,成功将BnTFL1基因RNAi重组载体转入中双11号中。整个转化周期从播种到得到生根抗性苗仅需大约70 d,大大缩短了转化周期,简化了转化过程,提高了转化效率。