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子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是由子宫内膜病变导致的恶性上皮性肿瘤，在发展中国家妇科恶性肿瘤中的发病率占据第二，作为发达国家最为常见的妇科恶性肿瘤，在女性生殖系统恶性肿瘤中所占比例为20%-30%。其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁女性健康。据美国癌症协会统计，2017年美国新诊断出的子宫内膜癌病例约为61380例，其中10920例死亡。虽然近年对子宫内膜癌的诊断和治疗取得了巨大进步，子宫内膜癌的预后要比卵巢癌、宫颈癌等女性生殖系统恶性肿瘤要好，但晚期患者5年生存率仅为10%~29%。早期发病的患者无明显自觉症状，患者常常不重视不会及时就诊治疗，较多患者是出现阴道不规则流血及排液、下腹疼痛、腹部出现肿块等情况时才来就诊，严重者出现转移或侵犯周围组织时就诊，这类患者就诊晚发现晚治疗效果及生活质量较差，生存时间较短。子宫内膜癌的诊断一般是结合患者临床病史特点、诊断性刮宫、病理组织检查、B超、CA125值及其他辅助的影像学检查确诊的。即使早期发现，转移和复发仍然是高死亡率的主要原因。然而，大多数子宫内膜癌是在晚期发病阶段诊断治疗的，且仍有部分肿瘤存在侵袭性，五年存活率<30%，增加了死亡的风险。而且现在子宫内膜癌发病人群的年龄越来越年轻，这些患者一旦确诊为子宫内膜癌，子宫切除的治疗方式使这些人群失去生育的机会，恶性肿瘤对患者身体造成伤害的同时，对心理及以后的生活都将造成恶劣的影响，治疗之后需要不断随访和后续观察，加重患者的经济负担。就目前为止，关于子宫内膜癌的发病原因及机制阐明的不是很透彻，从而影响了对子宫内膜癌尽早诊断与治疗后效果的评估。因此，如何从基因水平方面提高对疾病的早期诊治显得尤为重要，研究子宫内膜癌的生物学功能和发病机制显得十分迫切。
微小RNA是一类非编码的RNA分子，长度约为22个碱基，参与了多种生命活动行为，与肿瘤的发生与进展有紧密的关联。miR-125a-5p作为微小RNA中的成员，它对多种恶性肿瘤的生物学功能影响及机制越来越清晰，部分恶性肿瘤的预后与miR-125a-5p有着密切的关系。然而，至今miR-125a-5p与子宫内膜癌发生发展及侵袭能力的关系国内外的报道较少，仅提示miR-125a-5p的表达在子宫内膜癌患者组织样本和细胞系中较低，提示miR-125a-5p在子宫内膜癌的发生进展中有参与，但其对子宫内膜癌的作用机制目前尚无文献报道。
肿瘤的发生和发展是一种病理学过程，其中多个基因在其发生和发展中起到作用，细胞的增殖生长和死亡清除之间的平衡被打破是其中最为重要一部分机制，一方面细胞生长失控、过度繁殖，主要由于生长和增殖的信号过度刺激从而形成肿瘤；同时，细胞的凋亡被抑制，细胞无法按往常的程序死亡，但大多数肿瘤的形成都是这两种机制共同作用所导致的。伴随着人们对恶性肿瘤的探索及研究，学者们逐渐意识到在多种恶性肿瘤的发生发展中都存在着异常的信号传导通路。磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein Kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)是细胞内一条起关键作用的生存信号通路，肿瘤细胞的增殖，分化，凋亡，代谢及血管生成都与此信号通路的异常有关联。近年研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路活性增强及相关信号蛋白表达增加与子宫内膜癌的发生进展密切相关。已有文献报道，在子宫内膜癌中经常可见PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常表达，且在子宫内膜癌临床标本中的活性显著高于其他良性病变的子宫内膜组织。此外，Tang等的研究指出miR-125a-5p通过调控PI3K/AKT/mTOR通路活性抑制肝癌细胞侵袭和迁移。因此本研究在明确miR-125a-5p能够诱导子宫内膜癌细胞凋亡后，进一步研究其发挥作用的分子机制。
本课题主要从三个方面展开研究miR-125a-5p在不同人子宫内膜癌细胞株中的表达，并选取低表达miR-125a-5p的RL95-2细胞作为实验对象，通过上调其miR-125a-5p表达，进一步研究miR-125a-5p对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期的影响。同时研究miR-125a-5p过表达对凋亡相关蛋白的影响，应用Westernblot技术检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达，并进一步探讨可能涉及的分子学机制，为临床上治疗子宫内膜癌提供可能治疗靶点。
目的：
1.明确miR-125a-5p在Ishikawa、RL95-2及HEC-1B三株人子宫内膜癌细胞株中的表达水平。
2.明确miR-125a-5p对人子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期的生物学作用。
3.明确miR-125a-5p对凋亡相关蛋白的影响及对PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用，初步探讨其作用机制。
方法：
1.选取三种子宫内膜癌细胞Ishikawa、RL95-2及HEC-1B，将其接种于培养板内，待生长至对数期，qRT-PCR检测各组细胞miR-125a-5p的表达水平。
2.利用细胞转染技术构建过表达miR-125a-5p的人子宫内膜癌细胞株RL95-2，同时设置未转染组(Control)和mimic阴性对照组(mimic-NC)，提取细胞RNA和细胞总蛋白，用qRT-PCR方法测定三组RNA的表达水平。
3.采用MTT实验检测RL95-2细胞的增殖；流式细胞术对转染成功的RL95-2细胞进行凋亡及细胞周期的检测；Transwell实验、划痕实验对其侵袭及迁移能力进行检测。
4.对人子宫内膜癌细胞株RL95-2进行转染miR-125a-5pmimic，提取细胞总蛋白，用Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3、cytochromeC的表达水平。
5.对人子宫内膜癌细胞株RL95-2进行转染miR-125a-5pmimic后，提取细胞总蛋白，用Westernblot法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR相关蛋白表达水平。
结果：
1.qRT-PCR检测Ishikawa、RL95-2及HEC-1B三种人子宫内膜癌细胞中miR-125a-5p表达水平，结果显示：三种人子宫内膜癌细胞中RL95-2细胞中miR-125a-5p的表达量最低。
2.利用细胞转染技术构建过表达miR-125a-5p的人子宫内膜癌细胞株RL95-2，分为miR-125a-5pmimic组、未转染组(Control)和mimic阴性对照组(mimic-NC)三组，同Control组比较，mimic-NC组中miR-125a-5p的表达未发生显著变化，而转染组中miR-125a-5p的表达较mimic-NC组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明过表达miR-125a-5p的RL95-2细胞构建成功。
3.MTT法检测结果显示，转染miR-125a-5p后，mimic转染组中细胞在各个时间点的增殖率较mimic-NC组均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。同Control组比较，mimic-NC组细胞的增殖能力未发生明显变化。
4.流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，Control组、mimic-NC组、mimic组细胞早期凋亡率分别为4.9%、5.4%和17.3%，mimic组细胞凋亡率较mimic-NC组明显升高。
5.PI单染标记法检测结果显示，mimic-NC组各个时期细胞比例同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组G1期细胞比例明显增加，伴随S和G2期细胞比例显著减少(P＜0.01或P＜0.05)。
6.划痕实验结果显示，mimic-NC组细胞的迁移能力同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组细胞的迁移能力明显受到抑制，划痕伤口愈合变慢(P＜0.01)。
7.Transwell实验结果显示，mimic-NC组细胞侵袭数量同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组细胞侵袭数量明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
8.Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3、cytochromeC的表达，同mimic-NC组比较，发挥促进细胞凋亡作用的蛋白Bax、cleavedcaspase3的表达显著增加，起到抗凋亡作用的蛋白Bcl-2和线粒体cytochromeC的表达显著减少，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，而mimic-NC组中各指标的表达较Control组未发生明显变化。
9.Westernblot检测通路相关蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的表达，AKT和mTOR在Control、mimic-NC、mimic三组中的蛋白水平均未发生显著变化，同mimic-NC组比较，mimic组中p-AKT和p-mTOR的表达显著减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而mimic-NC组中两指标的表达较Control组未发生明显变化。
结论：
1.上调miR-125a-5p可显著抑制子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、侵袭和迁移的能力，显著促进细胞凋亡，具有阻滞细胞周期的作用，提示miR-125a-5p在子宫内膜癌发生进展中起抑癌基因作用。
2.miR-125a-5p过表达后发挥促凋亡作用的蛋白Bax、cleavedcaspase3表达显著增加，起抗凋亡作用的蛋白Bcl-2和线粒体cytochromeC表达明显减少，进一步证明miR-125a-5p诱导子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡。
3.p-AKT和p-mTOR参与子宫内膜癌的发生发展，推测miR-125a-5p可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响子宫内膜癌的形成及发生发展。
综上所述，miR-125a-5p在子宫内膜癌RL95-2细胞中呈低表达，可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性，调节子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡相关因子的表达情况，促进肿瘤细胞凋亡，抑制子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、侵袭及迁移，阻滞细胞周期，在子宫内膜癌的进展及形成过程中发挥抑癌作用。miR-125a-5p之后很有可能在子宫内膜癌临床治疗方面成为潜在的基因靶点，为以后进一步阐明子宫内膜癌机制和潜在的分子靶向治疗提供了初步的理论依据，但miR-125a-5p可能作用的靶点基因仍有待进一步研究。
微小RNA是一类非编码的RNA分子，长度约为22个碱基，参与了多种生命活动行为，与肿瘤的发生与进展有紧密的关联。miR-125a-5p作为微小RNA中的成员，它对多种恶性肿瘤的生物学功能影响及机制越来越清晰，部分恶性肿瘤的预后与miR-125a-5p有着密切的关系。然而，至今miR-125a-5p与子宫内膜癌发生发展及侵袭能力的关系国内外的报道较少，仅提示miR-125a-5p的表达在子宫内膜癌患者组织样本和细胞系中较低，提示miR-125a-5p在子宫内膜癌的发生进展中有参与，但其对子宫内膜癌的作用机制目前尚无文献报道。
肿瘤的发生和发展是一种病理学过程，其中多个基因在其发生和发展中起到作用，细胞的增殖生长和死亡清除之间的平衡被打破是其中最为重要一部分机制，一方面细胞生长失控、过度繁殖，主要由于生长和增殖的信号过度刺激从而形成肿瘤；同时，细胞的凋亡被抑制，细胞无法按往常的程序死亡，但大多数肿瘤的形成都是这两种机制共同作用所导致的。伴随着人们对恶性肿瘤的探索及研究，学者们逐渐意识到在多种恶性肿瘤的发生发展中都存在着异常的信号传导通路。磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein Kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)是细胞内一条起关键作用的生存信号通路，肿瘤细胞的增殖，分化，凋亡，代谢及血管生成都与此信号通路的异常有关联。近年研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路活性增强及相关信号蛋白表达增加与子宫内膜癌的发生进展密切相关。已有文献报道，在子宫内膜癌中经常可见PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常表达，且在子宫内膜癌临床标本中的活性显著高于其他良性病变的子宫内膜组织。此外，Tang等的研究指出miR-125a-5p通过调控PI3K/AKT/mTOR通路活性抑制肝癌细胞侵袭和迁移。因此本研究在明确miR-125a-5p能够诱导子宫内膜癌细胞凋亡后，进一步研究其发挥作用的分子机制。
本课题主要从三个方面展开研究miR-125a-5p在不同人子宫内膜癌细胞株中的表达，并选取低表达miR-125a-5p的RL95-2细胞作为实验对象，通过上调其miR-125a-5p表达，进一步研究miR-125a-5p对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期的影响。同时研究miR-125a-5p过表达对凋亡相关蛋白的影响，应用Westernblot技术检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达，并进一步探讨可能涉及的分子学机制，为临床上治疗子宫内膜癌提供可能治疗靶点。
目的：
1.明确miR-125a-5p在Ishikawa、RL95-2及HEC-1B三株人子宫内膜癌细胞株中的表达水平。
2.明确miR-125a-5p对人子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期的生物学作用。
3.明确miR-125a-5p对凋亡相关蛋白的影响及对PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用，初步探讨其作用机制。
方法：
1.选取三种子宫内膜癌细胞Ishikawa、RL95-2及HEC-1B，将其接种于培养板内，待生长至对数期，qRT-PCR检测各组细胞miR-125a-5p的表达水平。
2.利用细胞转染技术构建过表达miR-125a-5p的人子宫内膜癌细胞株RL95-2，同时设置未转染组(Control)和mimic阴性对照组(mimic-NC)，提取细胞RNA和细胞总蛋白，用qRT-PCR方法测定三组RNA的表达水平。
3.采用MTT实验检测RL95-2细胞的增殖；流式细胞术对转染成功的RL95-2细胞进行凋亡及细胞周期的检测；Transwell实验、划痕实验对其侵袭及迁移能力进行检测。
4.对人子宫内膜癌细胞株RL95-2进行转染miR-125a-5pmimic，提取细胞总蛋白，用Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3、cytochromeC的表达水平。
5.对人子宫内膜癌细胞株RL95-2进行转染miR-125a-5pmimic后，提取细胞总蛋白，用Westernblot法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR相关蛋白表达水平。
结果：
1.qRT-PCR检测Ishikawa、RL95-2及HEC-1B三种人子宫内膜癌细胞中miR-125a-5p表达水平，结果显示：三种人子宫内膜癌细胞中RL95-2细胞中miR-125a-5p的表达量最低。
2.利用细胞转染技术构建过表达miR-125a-5p的人子宫内膜癌细胞株RL95-2，分为miR-125a-5pmimic组、未转染组(Control)和mimic阴性对照组(mimic-NC)三组，同Control组比较，mimic-NC组中miR-125a-5p的表达未发生显著变化，而转染组中miR-125a-5p的表达较mimic-NC组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明过表达miR-125a-5p的RL95-2细胞构建成功。
3.MTT法检测结果显示，转染miR-125a-5p后，mimic转染组中细胞在各个时间点的增殖率较mimic-NC组均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。同Control组比较，mimic-NC组细胞的增殖能力未发生明显变化。
4.流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，Control组、mimic-NC组、mimic组细胞早期凋亡率分别为4.9%、5.4%和17.3%，mimic组细胞凋亡率较mimic-NC组明显升高。
5.PI单染标记法检测结果显示，mimic-NC组各个时期细胞比例同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组G1期细胞比例明显增加，伴随S和G2期细胞比例显著减少(P＜0.01或P＜0.05)。
6.划痕实验结果显示，mimic-NC组细胞的迁移能力同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组细胞的迁移能力明显受到抑制，划痕伤口愈合变慢(P＜0.01)。
7.Transwell实验结果显示，mimic-NC组细胞侵袭数量同Control组比较无明显变化，差异无统计学意义；同mimic-NC组比较，mimic组细胞侵袭数量明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
8.Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3、cytochromeC的表达，同mimic-NC组比较，发挥促进细胞凋亡作用的蛋白Bax、cleavedcaspase3的表达显著增加，起到抗凋亡作用的蛋白Bcl-2和线粒体cytochromeC的表达显著减少，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，而mimic-NC组中各指标的表达较Control组未发生明显变化。
9.Westernblot检测通路相关蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的表达，AKT和mTOR在Control、mimic-NC、mimic三组中的蛋白水平均未发生显著变化，同mimic-NC组比较，mimic组中p-AKT和p-mTOR的表达显著减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而mimic-NC组中两指标的表达较Control组未发生明显变化。
结论：
1.上调miR-125a-5p可显著抑制子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、侵袭和迁移的能力，显著促进细胞凋亡，具有阻滞细胞周期的作用，提示miR-125a-5p在子宫内膜癌发生进展中起抑癌基因作用。
2.miR-125a-5p过表达后发挥促凋亡作用的蛋白Bax、cleavedcaspase3表达显著增加，起抗凋亡作用的蛋白Bcl-2和线粒体cytochromeC表达明显减少，进一步证明miR-125a-5p诱导子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡。
3.p-AKT和p-mTOR参与子宫内膜癌的发生发展，推测miR-125a-5p可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响子宫内膜癌的形成及发生发展。
综上所述，miR-125a-5p在子宫内膜癌RL95-2细胞中呈低表达，可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性，调节子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡相关因子的表达情况，促进肿瘤细胞凋亡，抑制子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖、侵袭及迁移，阻滞细胞周期，在子宫内膜癌的进展及形成过程中发挥抑癌作用。miR-125a-5p之后很有可能在子宫内膜癌临床治疗方面成为潜在的基因靶点，为以后进一步阐明子宫内膜癌机制和潜在的分子靶向治疗提供了初步的理论依据，但miR-125a-5p可能作用的靶点基因仍有待进一步研究。