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干旱、低温是水稻生产中常见的非生物逆境。为了获得对低温、干旱有一定抗性的水稻新材料,本研究构建了与甜菜碱合成相关的山菠菜胆碱单加氧酶基因(AhCMO)、与耐低温相关的编码水稻碱性螺旋-环-螺旋类转录因子的OsbHLH1基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω-AhCMO和p3300-Ubi-Ω-OsbHLH1,并通过基因枪和农杆菌侵染的方法转化至水稻中,获得如下结果:
1.以pCAMBIA3300为母体骨架,利用玉米Ubiquitin启动子以及烟草花叶病毒mRNA非翻译区的翻译增强序列(Ω因子)分别构建了AhCMO、OsbHLH1基因的表达载体。
2.以常规粳稻东稻3号成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体,采用基因枪法将AhCMO、OsbHLH1基因分别导入东稻3号中。获得具有草铵膦抗性、转OsbHLH1基因的再生植株60株,具草铵膦抗性、转AhCMO基因的18株。
3.以常规粳稻武育粳3号成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌侵染法将AhCMO、OsbHLH1基因分别导入武育粳3号中。获得有草铵膦抗性、转OsbHLH1基因的再生植株20株,有草铵膦抗性、转AhCMO基因的21株。
4.对基因枪法获得的再生植株进行PCR和Southern检测,结果表明外源基因已经整合到水稻基因组中。
5.对基因枪法获得的再生植株的叶片用1 mg/mL的草铵膦涂布,结果表明,再生植株具有抗草铵瞵的能力,说明Bar基因在水稻中已经表达。转OsbHLH1基因T2代发芽筛选试验的结果表明Bar基因在T2代也能正常表达。
6.对转OsbHLH1基因的T1代植株在抽穗期进行日平均温度为17℃的低温处理,除了45号植株净光合速率变化率与非转基因对照没有显著差异外,其余的都显著低于对照,说明转OsbHLH1基因能够提高水稻抽穗期的耐低温能力;将转基因T2植株与非转基因对照在苗期低温处理(10℃,光下,10 h;5℃,黑暗,14 h),对实验结果进行成对样本T检验(t=0.014,df=5,P=0.989>0.05),结果说明,转基因T2代的苗期耐低温能力与对照没有显著差异。两个实验的结果说明各发育时期耐寒性没有相关性。