真菌对三种中药生长发育和有效成分影响的物质基础研究博士生：郭文娟导师：郭顺星研究员杨峻山研究员(中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所，北京，100094)本文从化学、生理生化及分析等方面较系统研究了两种真菌(蜜环菌、AR18号菌)对其宿主生长发育以及有效成分影响的物质基础，主要包括蜜环菌菌索的化学成分研究及其对猪苓菌丝生长及猪苓酮类成分的影响；蜜环菌菌索代谢产物对天麻种子萌发和发育的影响；AR18号菌化学成分研究及其对金线莲试管苗生长和黄酮类成分的影响。首次对天然蜜环菌菌索的化学成分进行了系统研究，运用硅胶、凝胶、聚酰胺柱层析等色谱方法结合质谱、核磁共振谱等现代波谱学技术从蜜环菌菌索中分离鉴定了13个单体化合物。主要是三萜和甾体类成分，包括三萜类化合物4个，分别是木栓酮，3α-hydroxyfriedel-2-one，3-hydroxyfriedel-3-en-2-one，3B-hydroxyglutin-5-ene；甾体类化合物3个，分别是麦角甾醇，麦角甾醇过氧化物，6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3β-ol；口山酮类化合物1个，为2-acetyl-1，3，8-trihy-droxyxanthone；脂肪酸类化合物3个，分别是十八烷酸，十八烷酸甲酯，二十四烷酸；小分子糖2个，分别是葡萄糖，甘露醇。其中3个为首次从真菌中分得，1个为首次从天然产物中分离。6个为从本届中首次分得。首次对3α-hydroxyfriedel-2-one，3-hydroxyfriedel-3-en-2-one，6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3β-ol的氢谱数据进行了全归属。为寻找蜜环菌菌索中促进猪苓生长的物质基础，应用真菌平板培养和HPLC等方法，系统研究了蜜环菌代谢产物对猪苓菌丝生长及猪苓酮类成分的影响。研究结果表明，蜜环菌菌索水提取物可以为猪苓菌丝生长提供碳源和氮源；蜜环菌菌索甲醇提取物对猪苓菌丝生长具有明显的促进作用，在培养末期猪苓菌落直径最大可以较对照提高13.5％；蜜环菌甲醇提取物的4个不同极性部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)中石油醚部位对猪苓促生长效果最显著，培养末期猪苓菌落直径较对照提高了26.4％；分离自石油醚部位的单体化合物Am4对猪苓菌丝生长有一定的促进作用，特别是在猪苓生长的初期有显著的促生长作用，表明Am4可能是蜜环菌促进猪苓生长活性物质的组成部分。来自蜜环菌的各诱导子都促进了猪苓菌丝中猪苓酮类成分的产生或积累。且这种诱导作用随着诱导子成分的复杂化而加强，其中以蜜环菌菌索甲醇提取物的石油醚部位诱导的猪苓酮类成分最多，共可诱导14个。为寻找蜜环菌菌索中抑制天麻种子萌发及促进天麻营养繁殖的物质基础，应用组织培养、显微观察等方法研究了蜜环菌代谢产物对天麻种子萌发和发育的影响。研究结果表明，蜜环菌菌索中抑制天麻种子萌发的主要物质存在于极性大的水提取物中。来源于水提取物的上清液和蜜环菌多糖对天麻种子萌发的抑制作用与水提取物的作用相似，都延迟了天麻种子萌发的起始时间，降低了天麻种子萌发率，并且都随着浓度的增加，抑制作用逐渐加强，其中蜜环菌多糖的抑制效果最明显。蜜环菌甲醇提取物尽管对天麻种子萌发有一定的抑制作用，但有利于天麻的营养繁殖。进一步的研究表明，从蜜环菌甲醇提取物中获得的单体化合物麦角甾醇可以促进天麻种子的萌发并促进天麻原球茎的营养繁殖，麦角甾醇处理天麻原球茎的最高分化率为87.0％。为寻找AR18号菌促进金线莲生长的物质基础，系统研究了AR18号菌的化学成分及其对金线莲试管苗生长及黄酮类成分的影响。成功地在2吨发酵罐中进行了AR18号菌的深层液体发酵中试，并首次对AR18号菌(一种瘤菌根菌属的真菌)的化学成分进行了系统研究。运用硅胶、凝胶、聚酰胺柱层析等色谱方法从AR18号菌中共分得单体化合物35个，综合应用质谱、核磁共振谱等现代波谱学技术鉴定了其中33个化合物的结构，包括甾体类化合物8个，分别为麦角甾醇、麦角甾烯氧化物、麦角甾醇过氧化物、5α，6α-epoxy-24(R)-methylcholesta-7，22-dien-3β-ol、β-谷甾醇、豆甾醇、(22E，24R)-24-methyl-cholesta-5，22-dien-3β-ol、(24S)-24-methyl-5α-cholestan-3β-ol：黄酮类化合物2个，分别为5，7-二羟基-6-甲氧基黄酮、5，6，7-三羟基黄酮；蒽醌类化合物一个，为大黄素甲醚；核苷及其类似化合物6个，分别为腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶核苷、2-羟基4-氧-3，4，5，6-四氢嘧啶、鸟嘌呤核苷、核黄素：环肽类化合物2个，分别为吡咯骈[1，2a]3，6-二酮六氢吡嗪、(3R，SaR)-Hexahydro-3-(2-methylpropyl)pyrrolo[1，2a]pyrazine-1，4-dione；小分子化合物8个，分别为3-羧基吲哚、4，4-二甲基-1，7-庚二酸、4’-羟基苯乙醇、4’-羟基苯乙酸、琥珀酸、丙二酸、琥珀酸甲酯、5-羟甲基糠醛；含脂肪族类化合物4个，分别为α-棕榈精、5-二十五烷基-1，3-苯二酚、二十烷酸甲酯、2，4-十五二烯；小分子糖2个，分别为D-甘露醇、葡萄糖。以上化合物均为从该属真菌中首次分得。应用组织培养和HPLC等方法研究了AR18号菌代谢产物对金线莲试管苗生长及黄酮类成分的影响。研究结果表明：AR18号菌的发酵液乙醇提取物和菌丝体乙醇提取物对金线莲生长都有明显的促进作用，分别可以使金线莲的鲜重增加倍数较对照提高24.5％和14.6％，使金线莲的干重增加倍数较对照提高29.9％和15.9％，而且这两个诱导子都有利于金线莲黄酮类成分的积累。进一步研究发现AR18号菌促进金线莲生长的活性成分主要存在于发酵液乙醇提取物的乙酸乙酯部位和菌丝体乙醇提取物的正丁醇部位，这两个部位分别可以使金线莲的鲜重增加倍数较对照提高38.3％和31.8％；使金线莲的干重增加倍数较对照提高59.1％和37.4％。通过单因素试验、正交试验对上述两个部位分离得到的单体化合物进行金线莲试管苗促生长活性的筛选，发现化合物AR7和AR10可以显著提高金线莲试管苗的鲜重增加倍数和干重增加倍数，分别可以使金线莲的鲜重增加倍数较对照提高20.4％和17.5％，使金线莲的干重增加倍数较对照提高23.0％和21.0％，且这两个化合物对金线莲黄酮类成分影响不大。AR7在发酵液乙醇提取物的乙酸乙酯部位和菌丝体乙醇提取物的正丁醇部位中都有存在，该化合物可能是AR18号真菌促进金线莲生长的活性物质之一。AR18号菌代谢产物对金线莲试管苗黄酮类成分的种类没有影响，但对含量影响较大。诱导子的种类、浓度对不同的黄酮类成分诱导效果不同，AR18号菌发酵液和菌丝体提取物处理都能提高6种黄酮总含量，主要提高了fla-3的含量，最高达到对照的18倍。发酵液提取物乙酸乙酯部位处理的金线莲中6种黄酮含量均高于对照，且随着诱导子浓度的增加，各黄酮含量也呈上升趋势。发酵液提取物的石油醚、正丁醇、水部位处理金线莲6种黄酮总含量都与对照接近，对各黄酮类成分的影响也不相同。但发酵液的4个极性部位都提高了fla-5含量，以水部位处理的作用效果最明显，可以达到对照的5.15倍。菌丝体提取物石油醚部位能降低金线莲中已知黄酮类成分总含量，尤以对fla-3的含量影响明显，仅为对照的24％；菌丝体提取物乙酸乙酯、水部位处理的金线莲中6种已知黄酮总含量与对照接近；菌丝体提取物的正丁醇部位各处理金线莲中6种黄酮总含量均高于对照，作用强度与浓度呈正相关。用对金线莲生长有利的两个单体化合物AR7、AR10处理后的金线莲其已知黄酮总含量随着诱导子浓度增加呈下降趋势。综合分析AR7(m)处理既可以促进金线莲的生长，又不影响黄酮类成分的积累。进一步的研究表明，AR7可以通过提高金线莲叶片的光合速率和诱导IAA的产生或积累来促进金线莲的生长。