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水体溶解氧(dissolved oxygen,DO)含量是水生生物生存的关键因子之一,影响其生长发育、新陈代谢、繁殖等生命过程。低氧常给水产养殖生物的正常生长存活等活动造成威胁,而且复杂多变的环境中的胁迫因子常会叠加出现,尤其是夏季水体温度升高,会导致溶解氧降低、病原菌数量增加、p H改变等,多种因子相互协同会加速对水生生物的胁迫。很多水生生物在进化过程中,形成了对低氧等逆境胁迫的耐受和适应能力,但这种机体耐受和适应也会受到其他很多因素的影响。魁蚶(Scapharca broughtonii)是一种大型经济蚶类,在我国北方有浅海筏式养殖、底播养殖和池塘养殖等多种模式,由于其移动性较差,常受到低氧环境的胁迫。有关低氧胁迫对魁蚶存活、生理生化以及分子水平影响的相关研究已有较多报道,但是其他因子对其耐低氧的影响相关研究较少。本研究以魁蚶为研究对象,探究了两种处理,即低氧预适应和病原菌刺激,对魁蚶耐低氧的影响,主要内容包括以下三个方面:(1)对魁蚶进行低氧预适应处理,分析了其在低氧胁迫下生理、生化指标的变化特征,探讨了低氧预适应对魁蚶低氧耐受的影响;(2)通过比较基因组学分析,筛选获得魁蚶收缩、扩张的基因家族以及正选择基因,探讨其在低氧耐受与适应中的潜在功能;(3)利用比较转录组分析了哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激组与未刺激组魁蚶在低氧胁迫下的响应差异,筛选获得差异基因并进行了富集等分析,探讨了哈维氏弧菌刺激对魁蚶低氧响应的影响。主要内容如下:1、以未进行低氧预适应的魁蚶为对照组(C组),分析了进行2次低氧预适应(H2组)和4次低氧预适应(H4组)的魁蚶在溶解氧浓度约为2.0 mg/L低氧胁迫48 h内的摄食、呼吸代谢和酶活性的变化规律。结果显示,3组魁蚶的摄食率(IR)在胁迫初期急剧下降,后期均随时间的延长逐渐恢复,至48 h时H组恢复程度显著高于C组(P<0.05);C组、H2组和H4组魁蚶的耗氧率(OR)随时间呈逐渐升高的趋势,48 h时比0 h分别提高1.15、1.08、0.73倍;3组排氨率(NR)表现出不同的变化趋势,至48 h时分别是0 h的1.67、1.30、0.97倍;C组的氧氮比(O/N)值相对平稳,H组的变化范围相对较大。3组的细胞色素C氧化酶(COX)随着低氧胁迫时间的延长呈现逐渐降低的趋势,乳酸脱氢酶(LDH)活性和还原型谷胱甘肽酶(GSH)含量整体呈上升趋势,与对照组相比,预低氧组的酶活性在低氧胁迫期间变化相对平稳,应激反应小。2、利用课题组已构建的魁蚶基因组及下载的其他13个物种的基因组信息进行了基因家族聚类、系统发育树、基因家族的扩张和收缩、正选择等比较基因组学分析。系统发育树显示,魁蚶首先与泥蚶聚为一支,分歧时间为~68.5 Mya;魁蚶共有727个基因家族发生了扩张、563个基因家族发生了收缩,其中显著扩张的基因家族有48个(P<0.05);以目标物种(魁蚶、泥蚶)作为前景支,其他物种作为背景支,得到81个受正选择基因(P<0.05)。48个显著扩张基因家族的KEGG和GO富集结果表明,这些基因多被富集到糖、脂质和氨基酸的代谢通路中,具体的代谢途径包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、丙酮酸代谢、抗坏血酸和醛糖代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酮体的合成与降解、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生和赖氨酸降解等能量代谢途径。已有大量研究表明,动物在受到低氧胁迫时,能量代谢途径在机体面对低氧胁迫时发挥重要作用,这些显著扩张的基因家族可能与魁蚶耐低氧响应相关。对81个正选择基因进行分析发现,其中9个基因在已有研究中显示与生物的低氧耐受相关,分别是:核受体共激活剂4(Ncoa4)、MYC结合蛋白(Mycbp)、烯醇化酶(Eno4)、MED蛋白基因(Med1)、核糖核酸酶基因(Rnc)等。3、以未经任何处理的魁蚶为空白对照组(NH组),注射50μL 1M PBS为处理对照组(SH组),注射50μL 2×10~8CFU/m L哈维氏弧菌为处理组(VH组),三组魁蚶相同条件养殖24 h后,统一用DO为2.5 mg/L的条件进行低氧胁迫,取0 h、8 h、16 h、24 h和48 h鳃组织进行转录组测序分析。结果显示:共得到319.80 Gb Clean Data,各样品均值达到5.97 Gb;共注释获得13,683个基因;对NH组单独进行分析,与0 h组对比,发现随着低氧胁迫时间的延长,差异基因数目增多,说明低氧胁迫对魁蚶机体造成了影响,48 h时差异基因数目达到最大值为2,392个,差异基因多集中在吞噬体(ko04145)、糖酵解/糖异生信号(ko00010)、磷脂酰肌醇信号传导系统(ko04070)、细胞色素CP450代谢(ko00980)、谷胱甘肽代谢(ko00480)、酮体的合成和降解(ko00072)等通路上;同时间点的SH组与NH组对比,发现差异基因数量相对于VH vs NH较少;同时间点VH组与NH组的对比,发现差异基因数目在0 h和8 h时数量最多,分别为1,433和1,566个,KEGG分析表明这些差异基因被富集到PI3K-AKT信号(ko04151)、碳代谢(ko01200)、嘌呤代谢(ko00230)、脂肪酸生物合成(ko00061)以及MAPK(ko04010)等通路。研究结果表明注射哈维氏弧菌改变了魁蚶对低氧在转录水平的响应,差异基因主要富集在代谢相关通路。