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小麦是全球最重要的粮食作物之一，但小麦的产量却因环境胁迫的不断加重而倍受影响。因此，挖掘小麦抗逆基因资源对于提高小麦耐盐和抗旱能力非常必要。对生物胁迫和非生物胁迫的一个常见应对是脯氨酸(Pro)的积累。鸟氨酸氨基转移酶(OAT)又称为δ-鸟氨酸氨基转移酶(δOAT),是一种依赖于吡哆醛磷酸盐（PLP）的酶，参与鸟氨酸与谷氨酰5-半醛(GSA)的转换。鸟氨酸氨基转移酶是一种高度保守的酶，在脯氨酸(Pro)生物合成过程中催化鸟氨酸(Orn)转氨化为5-半醛(GSA)。该酶通过参与鸟氨酸途径，在逆境胁迫下植物产生的脯氨酸积累、细胞程序化死亡和非宿主疾病抗性中发挥作用。迄今为止，OAT基因已在水稻、玉米和高粱等植物中克隆并进行了功能鉴定，但在小麦中还没有关于OAT基因的研究。本研究拟对小麦中的OAT基因进行克隆和分子鉴定，并在小麦中分别对TaOAT和AtOAT基因进行功能分析。研究结果对于挖掘耐环境胁迫的基因资源和培育抗逆小麦新品种具有重要理论和实践意义。主要研究结果如下：
1）通过生物信息分析、PCR扩增和测序验证等手段，在小麦第5部分同源群染色体上共鉴定了3个TaOAT同源基因，分别为TaOAT-5AL、TaOAT-5BL和TaOAT-5DL。进一步对这3个基因gDNA序列与其对应的cDNA序列进行比对，发现TaOAT基因有10个外显子和9个内含子。同时发现，TaOAT-5AL存在2种类型的转录本，其中一个转录本在第9外显子和第8内含子之间出现了中断基因表达的序列结构。
2）构建OAT系统进化树结果表明，OAT在原核生物和真核动植物之间高度保守。在真核植物中，OAT明显形成了2个群体，一组为单子叶植物，另一组为双子叶植物。利用WebLogo生成序列徽标分析法，进一步证实了OAT在植物之间的保守性。亚细胞定位分析显示，OAT在线粒体中发挥作用。蛋白质互作分析表明，TaOAT通过与1-δ-吡咯啉-5-羧酸酯合成酶(P5CS),吡咯啉-5-羧酸酯还原酶（P5CR）和精氨酸酶(ARG)等编码基因相互作用在脯氨酸生物合成和氮再利用中发挥作用。启动子分析显示OAT有多种胁迫响应元件存在，如脱落酸响应元件(ABRE)、原粒细胞增多症(MYB)顺式元件、ROS相关基序(G-box和W-box)、乙烯响应元件(ERE)、热激元件、类APETALA2(AP-2-like)元件和低温响应（LTR）元件，表明这些胁迫响应元件参与了胁迫调节。利用实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)对小麦植株分别在50％PEG和200mM NaCl胁迫条件下的基因表达分析显示，TaOAT高度诱导表达。与旱敏感型品种相比，其表达在抗旱型品种中高度上调。AP-2类顺式作用元件的存在表明其在小花发育中可能发挥作用。在抽穗期的雄蕊中观察到TaOAT的表达上调，这表明其在花药裂开中存在发挥作用。
3）利用农杆菌转化法将TaOAT-5BL在小麦中进行了过表达，对转基因植株及其后代进行了Bar试纸条和PCR检测，获得了稳定转基因株系。半定量RT-PCR结果显示，转基因株系中TaOAT-5BL表达量显著高于对照。将转基因株系和对照的成熟胚分别接种于含150mM NaCI培养基上进行抗盐性鉴定，发现转基因株系萌发率（71-85%）显著高于对照（27%）。盐胁迫30天后存活率调查显示，转基因植株存活率（35-40%）显著高于野生型（12%）。同时，对转基因株系幼苗从三叶期开始进行水分胁迫处理，旱胁迫处理后17天发现对照植株的生长受到严重影响，而转基因株系生长正常。游离脯氨酸含量分析结果表明，正常条件下转基因植株脯氨酸含量与野生型没有差异，干旱胁迫条件下转基因株系比野生型植物积累了更多的脯氨酸。
4）为了进一步解析OAT酶的功能，利用农杆菌介导法将拟南芥AtOAT基因分别转入旱敏感小麦品种Fielder和旱耐受型品种宁春4号。通过单倍体技术获得了纯合稳定转基因株系，经过染色体原位杂交等分子鉴定，从2类转基因植株中各选择3个稳定转基因株系对其中的AtOAT基因进行功能分析。半定量PCR显示，转入的目标基因在转基因小麦植株中高表达。耐盐性鉴定结果表明，宁春4号转基因株系在200mM NaCl培养基上的存活率显著高于宁春4号，Fielder转基因株系在150mMNaCl培养基上存活率显著高于野生型。生理指标分析发现，在盐胁迫条件下转基因株系中脯氨酸含量比野生型显著提高，转基因植株中POD活性也比对照增强。同时发现，Fielder转基因株系水分胁迫15天时的存活率显著高于Fielder，宁春4号转基因株系水分胁迫18天时的存活率显著高于宁春4号。另外，在干旱胁迫下转基因株系与野生型相比脯氨酸含量和POD活性显著增加。
5）实时定量PCR分析结果表明，转AtOAT基因小麦株系中AtOAT基因表达上调了脯氨酸生物合成途径中相关基因TaOAT、TaP5CS和TaP5CR等的表达，下调了脯氨酸分解代谢相关基因TaP5CDH的表达。同时发现，参与鸟氨酸途径Orn-OAT-P5C和GSA-P5CR-Pro中的相关基因在转基因小麦植株中的表达上调，而参与谷氨酸途径Glu-P5CS-P5C/GSA-P5CR-Pro中的相关基因在转基因小麦植株中的表达也上调。认为AtOAT在逆境胁迫条件下通过激活谷氨酸途径和鸟氨酸途径参与脯氨酸的生物合成。
1）通过生物信息分析、PCR扩增和测序验证等手段，在小麦第5部分同源群染色体上共鉴定了3个TaOAT同源基因，分别为TaOAT-5AL、TaOAT-5BL和TaOAT-5DL。进一步对这3个基因gDNA序列与其对应的cDNA序列进行比对，发现TaOAT基因有10个外显子和9个内含子。同时发现，TaOAT-5AL存在2种类型的转录本，其中一个转录本在第9外显子和第8内含子之间出现了中断基因表达的序列结构。
2）构建OAT系统进化树结果表明，OAT在原核生物和真核动植物之间高度保守。在真核植物中，OAT明显形成了2个群体，一组为单子叶植物，另一组为双子叶植物。利用WebLogo生成序列徽标分析法，进一步证实了OAT在植物之间的保守性。亚细胞定位分析显示，OAT在线粒体中发挥作用。蛋白质互作分析表明，TaOAT通过与1-δ-吡咯啉-5-羧酸酯合成酶(P5CS),吡咯啉-5-羧酸酯还原酶（P5CR）和精氨酸酶(ARG)等编码基因相互作用在脯氨酸生物合成和氮再利用中发挥作用。启动子分析显示OAT有多种胁迫响应元件存在，如脱落酸响应元件(ABRE)、原粒细胞增多症(MYB)顺式元件、ROS相关基序(G-box和W-box)、乙烯响应元件(ERE)、热激元件、类APETALA2(AP-2-like)元件和低温响应（LTR）元件，表明这些胁迫响应元件参与了胁迫调节。利用实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)对小麦植株分别在50％PEG和200mM NaCl胁迫条件下的基因表达分析显示，TaOAT高度诱导表达。与旱敏感型品种相比，其表达在抗旱型品种中高度上调。AP-2类顺式作用元件的存在表明其在小花发育中可能发挥作用。在抽穗期的雄蕊中观察到TaOAT的表达上调，这表明其在花药裂开中存在发挥作用。
3）利用农杆菌转化法将TaOAT-5BL在小麦中进行了过表达，对转基因植株及其后代进行了Bar试纸条和PCR检测，获得了稳定转基因株系。半定量RT-PCR结果显示，转基因株系中TaOAT-5BL表达量显著高于对照。将转基因株系和对照的成熟胚分别接种于含150mM NaCI培养基上进行抗盐性鉴定，发现转基因株系萌发率（71-85%）显著高于对照（27%）。盐胁迫30天后存活率调查显示，转基因植株存活率（35-40%）显著高于野生型（12%）。同时，对转基因株系幼苗从三叶期开始进行水分胁迫处理，旱胁迫处理后17天发现对照植株的生长受到严重影响，而转基因株系生长正常。游离脯氨酸含量分析结果表明，正常条件下转基因植株脯氨酸含量与野生型没有差异，干旱胁迫条件下转基因株系比野生型植物积累了更多的脯氨酸。
4）为了进一步解析OAT酶的功能，利用农杆菌介导法将拟南芥AtOAT基因分别转入旱敏感小麦品种Fielder和旱耐受型品种宁春4号。通过单倍体技术获得了纯合稳定转基因株系，经过染色体原位杂交等分子鉴定，从2类转基因植株中各选择3个稳定转基因株系对其中的AtOAT基因进行功能分析。半定量PCR显示，转入的目标基因在转基因小麦植株中高表达。耐盐性鉴定结果表明，宁春4号转基因株系在200mM NaCl培养基上的存活率显著高于宁春4号，Fielder转基因株系在150mMNaCl培养基上存活率显著高于野生型。生理指标分析发现，在盐胁迫条件下转基因株系中脯氨酸含量比野生型显著提高，转基因植株中POD活性也比对照增强。同时发现，Fielder转基因株系水分胁迫15天时的存活率显著高于Fielder，宁春4号转基因株系水分胁迫18天时的存活率显著高于宁春4号。另外，在干旱胁迫下转基因株系与野生型相比脯氨酸含量和POD活性显著增加。
5）实时定量PCR分析结果表明，转AtOAT基因小麦株系中AtOAT基因表达上调了脯氨酸生物合成途径中相关基因TaOAT、TaP5CS和TaP5CR等的表达，下调了脯氨酸分解代谢相关基因TaP5CDH的表达。同时发现，参与鸟氨酸途径Orn-OAT-P5C和GSA-P5CR-Pro中的相关基因在转基因小麦植株中的表达上调，而参与谷氨酸途径Glu-P5CS-P5C/GSA-P5CR-Pro中的相关基因在转基因小麦植株中的表达也上调。认为AtOAT在逆境胁迫条件下通过激活谷氨酸途径和鸟氨酸途径参与脯氨酸的生物合成。