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目的:将人类牙龈间充质干细胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)系统移植到伴高脂血症的牙周炎小鼠模型中,观察牙龈间充质干细胞对小鼠脂质代谢及炎症的调节作用,为临床治疗伴高脂血症乃至其他系统性疾病的牙周炎提供新的思路。 方法: 1、通过酶消化法从人类牙龈组织中分离GMSCs,采用克隆形成率实验、成骨成脂诱导分化实验、流式细胞术对细胞的干细胞特性进行鉴定,并使用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染标记细胞。 2、8周龄雄性C57BL/6J小鼠20只记为A组,相同基因背景ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只随机分为B、C两组,每组20只。所有小鼠均进行高脂饮食喂养,每周检测体重,并于高脂喂养第0、4、8、9、10、12周内眦静脉取血,于全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、LDL、HDL水平,用ELISA法检测血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平。小鼠12周龄时,丝线结扎ApoE-/-小鼠双侧上颌第二磨牙,并于结扎4周后,三组小鼠每组分别处死2只。截取带有上颌磨牙的两侧牙槽骨,经亚甲蓝染色后体式显微镜下拍照,软件测量釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离(牙槽骨吸收程度)。通过尾静脉将带有GFP标记的细胞移植入C组小鼠体内,B组则注射等量α-MEM培养基作为对照,A组未行任何处理。GMSCs移植后1、2、4周三组分别处死6只小鼠,取出小鼠肝脏,RT-PCR法检测小鼠肝脏组织内PPARαmRNA、SREBP-1cmRNA水平。截取带有上颌磨牙的两侧牙槽骨,左侧上颌牙槽骨经亚甲蓝染色后体式显微镜下观察,软件测量牙槽骨吸收程度。右侧上颌牙槽骨HE染色后在光学显微镜下观察上颌第二磨牙区的组织学变化,进行DAPI染液细胞核染色及抗GFP免疫组化染色观察GFP标记的细胞在小鼠体内迁移和分化情况。 结果: 1、利用酶消化法成功从人类牙龈组织中分离获得牙龈间充质干细胞,并且获得细胞可以形成克隆集落,在特定诱导条件下可以向成脂、成骨方向分化,流式细胞术检测细胞高度表达间充质干细胞标志物CD73、CD90、CD105和STRO-1,不表达CD45和CD31。使用带有GFP的慢病毒成功转染GMSCs,转染后的细胞GFP表达率在90%以上。 2、ApoE-/-小鼠高脂喂养4周后丝线结扎4周,血脂显著升高;ApoE-/-小鼠上颌牙槽骨吸收程度显著高于C57小鼠。荧光显微镜观察和免疫组化染色分析可见移植细胞后1、2周,C组上颌牙周病损区可见大量GFP+成纤维细胞状细胞。移植4周后牙槽骨边缘骨陷窝处可见GFP+成骨细胞。HE染色显示,C组牙槽骨高度显著高于B组,C组龈缘炎症细胞浸润明显少于B组。亚甲蓝染色后可见C组上颌牙槽骨吸收程度显著小于B组(P<0.05)。血清学结果显示:移植后1、2、4周,与B组相比,C组TG、TC、LDL、IL-6和TNF-α明显下降,HDL和IL-10明显上升(P<0.05)。RT-PCR结果显示:在细胞移植后第1周,C组PPARαmRNA水平明显高于B组,SREBP-1cmRNA水平明显低于B组。在第2周,C组PPARαmRNA、SREBP-1cmRNA均明显低于B组。在第4周,C组PPARαmRNA、SREBP-1cmRNA均明显高于B组(P<0.05)。 结论: 1、酶消化法从牙龈组织中分离GMSCs操作简单,获得的细胞经鉴定具有干细胞的特性。携带GFP基因的慢病毒感染后的细胞能够稳定持久表达GFP,并于体外大量扩增。 2、高脂喂养ApoE-/-小鼠丝线结扎法,可以成功建立伴高脂血症的牙周炎模型,且该方法经济、省时,值得推广。经尾静脉系统移植的GMSCs不仅可以归巢至牙周病损区并参与组织再生,而且对全身脂质代谢及炎症有明显的调节作用。