胆固醇25羟化酶(CH25H)是一种定位在内质网膜的羟化酶,其主要功能是催化体内过剩的胆固醇,产生可溶性的25-羟基胆固醇(25HC),25HC可以通过调控核受体和固醇调节元件结合蛋白(SREBP)来控制胆固醇生物合成,从而减轻体内胆固醇的积累。近年来的研究还发现,CH25H是一种广泛的抗病毒宿主限制性因子,通过催化合成的25HC阻止病毒与细胞之间的膜融合,进而抑制病毒侵入。例如,25HC可显著抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、人类疱疹病毒(HSV)等病毒的增殖。猪δ冠状病毒(PDCoV)主要引起新生仔猪的呕吐、腹泻、脱水甚至死亡,是一种新发现的猪肠道冠状病毒,对养猪业造成了较大的经济损失。研究报道25HC处理降低了猪肺器官中PRRSV滴度,同时表现出良好的保护作用。据此,研究围绕CH25H对PDCoV增殖的影响及机制展开。本研究通过分析PDCoV感染后细胞CH25H的表达,研究CH25H及其酶活突变体对PDCoV增殖的影响,证实PDCoV感染诱导CH25H表达,CH25H可抑制PDCoV增殖但不完全依赖于其酶活。主要研究内容如下:1.PDCoV感染上调细胞内CH25H的表达将不同剂量的PDCoV(0.25 MOI,0.5 MOI,1.0 MOI)感染猪小肠上皮细胞(IPIFX),通过q RT-PCR和Western blot分析,发现PDCoV感染后12 h(hpi),CH25H的m RNA和蛋白水平均显著上调,且呈剂量依赖性。同时,分析了PDCoV(MOI=1)感染IPI-FX细胞后不同时间(6 hpi,12 hpi,18 hpi)CH25H m RNA和蛋白水平的变化,发现感染后6 h CH25H m RNA和蛋白水平无显著变化,但感染后12 h和18h CH25H的m RNA和蛋白水平均显著上调。2.CH25H抑制PDCoV增殖为了确定CH25H及其酶活突变体(CH25H-M)对PDCoV增殖的影响,将CH25H和CH25H-M的真核表达质粒分别转染IPI-FX细胞,然后接种PDCoV(MOI=0.5),通过q RT-PCR、空斑实验和间接免疫荧光实验检测PDCoV感染后12 h和18 h的增殖情况。发现超表达CH25H和CH25H-M均能显著抑制PDCoV的增殖,但CH25HM的抑制作用显著低于CH25H,表明CH25H可以抑制PDCoV增殖,但不完全依赖于其酶活。为了进一步确定CH25H是否是一种抗PDCoV感染的宿主限制性因子,采用特异性si RNA干扰IPI-FX细胞CH25H的表达,然后接种PDCoV(MOI=0.5),通过q RT-PCR和空斑实验检测PDCoV感染后18 h的增殖情况。发现干扰细胞的CH25H表达显著促进PDCoV增殖,表明CH25H是一种抗PDCoV感染的宿主限制性因子。3.25HC抑制PDCoV增殖进一步分析CH25H的催化产物25HC对PDCoV增殖的影响。将25HC(12.5μmol/L)预处理细胞IPI-FX细胞8 h,然后接种PDCoV(MOI=0.5),通过q RT-PCR、空斑实验和间接免疫荧光实验检测PDCoV感染后12 h和18 h的增殖情况。发现25HC处理显著抑制PDCoV的增殖,进一步证实CH25H可通过其酶活作用抑制PDCoV增殖。4.25HC抑制PDCoV的侵入为了确定25HC作用于PDCoV复制周期的具体环节,分析了25HC对PDCoV的吸附、侵入、复制、释放的影响,发现25HC可抑制PDCoV的侵入,但对吸附、复制和释放环节均没有显著影响,而且25HC在体外也不能直接灭活PDCoV。这些结果进一步表明25HC可能通过修饰细胞膜抑制PDCoV感染。