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药用植物内生菌所处生境独特,经过与植物的长期共同进化而具有合成新颖天然产物活性结构的巨大潜力。本实验室前期从19种药用植物中分离得到94株拮抗内生菌,论文通过多步骤活性检测方法,结合生物信息学分析对其抑菌机制进行初步预测,并利用基因工程和qPCR技术进行验证,来探索目标菌株的抑菌活性特征。论文主要包括如下四部分内容:1.多步骤活性检测方法确定目标菌株SAT1。将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为指示菌,以94株拮抗内生菌为研究对象,初步筛选得到8株抑菌效果较强(抑菌带宽>1.0 cm)的菌株。通过抑菌谱实验、发酵液抑菌活性实验以及离体枝条实验等多步骤分析,发现内生链霉菌SAT1对栗疫菌、白假丝酵母等八种指示菌均具有抑制效果,并且对欧美杨溃疡病和板栗疫病表现出一定的生防效果,优于其它菌株,因此,将其作为本论文的研究对象。2.SAT1次级代谢基因簇抑菌活性物质预测。通过antiSMASH分析Streptomyces sp.SAT1全基因组序列,一共预测到29种次级代谢产物生物合成基因簇。其中Cluster24和Cluster25与具有抑菌活性的潮霉素B和默诺霉素的生物合成基因簇分别有52%和88%的相似性。经同源性比对分析,Cluster24含有23个基因,与吸水链霉菌相比hygT、hygH、hygG、hygZ四个基因的蛋白同源性较低(仅为32%-40%);在Cluster25中,moeR5和S5同源性仅为28%和45%。因此,我们推测这两个基因簇可能合成潮霉素B和默诺霉素类的新物质。3.wblA强化表达突变株的抑菌活性。wblA基因为多效性负调控基因,多个研究表明该基因除了能够影响链霉菌孢子形成外还能够影响多种次级代谢产物的生成。本研究将两个含有wblA基因的不同长度的片段W1(2411 bp)和W2(854 bp)插入pSET152载体,分别获得wblA强化表达突变株SAT1-W1和SAT1-W2。抑菌结果表明,两株突变株的抑菌活性相较于野生型均有明显下降,说明wblA的强化表达对抑菌相关基因产生了抑制作用。4.通过qPCR技术分析Cluster24和Cluster25中相关基因表达量的影响。以看家基因rpoA和recA作为共同内参来检测目的基因的表达量。相对定量结果表明,wblA在SAT1-W1和SAT1-W2中的表达量分别增长为野生型的2.45倍和2.54倍。在SAT1-W1中,Cluster24中的hygM、hyg0、hygP三个基因几乎不再表达,而在SAT1-W2中分别降为原来的72-88%;另外Cluster25中的moeA5、moeP5、moeGT2在SATl-W1中的表达量下降为原来的29-60%,在SAT1-W2中反而升高了 1.19-1.95倍。因此我们猜测Cluster24所合成的物质具有抑制真菌的活性,而Cluster25指导产生的物质还需要进一步的验证。本论文详细研究了内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征以及可能发挥作用的次级代谢基因簇。为后续深入研究SAT1的抑菌机制、分离活性物质以及构建高产抗生素功能菌株提供了理论支持。