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溶瘤腺病毒作为治疗肿瘤的新兴疗法之一,近年来已经成为基因治疗领域令人瞩目的热点。刘新垣院士提出的“癌症的靶向基因病毒疗法”利用溶瘤腺病毒作为载体携带外源性抗癌基因。我们实验室已经利用ZD55系统构建出各种携带不同基因的溶瘤腺病毒,并在细胞水平和移植瘤动物模型中取得了较好的抗癌效果。
为了改善靶向基因病毒疗法,需要进一步提高溶瘤腺病毒的靶向性和肿瘤杀伤作用。我们将腺病毒EIB55K删除使得腺病毒由于晚期RNA无法输出而不能在正常细胞内进行复制,将E1A CR2的24bp序列缺失使之能靶向于Rb突变的肿瘤细胞,同时利用肿瘤特异性启动子survivin启动子控制E1A的表达;此外,利用Caspase-8的特异性酶切位点将促凋亡基因TRAIL和抑癌基因IL-24相连接,由此构建出双基因三靶向的溶瘤腺病毒。我们通过改进的AdEasy系统成功实现了腺病毒的重组,并且在HEK293细胞中包装出有活性的病毒颗粒。经过小量扩增、大量扩增和纯化后的病毒对20余株肿瘤细胞进行了初步筛选,发现这些肿瘤细胞株对于Ad-sp系列病毒的敏感性不一,其中尤以脑胶质瘤细胞U251最为敏感。然而,结晶紫染色的结果表明U251细胞对病毒的敏感性主要源于病毒复制而不是抗癌基因。于是,我们继续利用MTT法检测Ad-sp系列病毒对于包括肝癌细胞系、乳腺癌细胞系、胃癌细胞系、前列腺癌细胞系在内的多种细胞系的抑制作用。结果表明,携带双基因的Ad·spE1A(△24)·E1B(△55)-TRAIL-IETD-IL-24-△E3在多种肿瘤细胞系中杀伤作用优于只携带单基因的溶瘤腺病毒。Hoechst33342和PI双染色结果也证明,HuH-7细胞在感染后发生细胞凋亡。同时,在相同感染复数的条件下Ad-sp系列病毒对正常细胞MRC-5和QSG-7701的毒性很小。
在裸鼠皮下注射HuH-7细胞的肝癌移植瘤模型中,Ad·sp-E1A(△24)·E1B(△55)TRAIL-IETD-IL-24-AE3对于肿瘤生长的抑制作用优于只携带TRAIL或IL-24的Ad-sp病毒。
综上,我们成功构建了双基因三调控溶瘤腺病毒并细胞水平和裸鼠移植瘤模型中检测其肿瘤杀伤效果。结果表明,IETD序列介导双基因共表达的策略有效地增强了溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果。