1-研究背景糖尿病(DM)是一组以慢性血葡萄糖水平升高为特征的代谢疾病群,久病可引起多系统损害,给社会带来沉重负担,糖尿病的发病率不断升高,预计到2025年全世界糖尿病患者将增至3亿。尤其是在发展中国家发病率增长较快,我国糖尿病患者人数仅次于印度,居世界第二位。糖尿病的并发症多且较为严重,其并发症随着病程的延长,主要表现为冠心病、脑血管和外周血管病变、肾病和视网膜病变、糖尿病骨质疏松等。目前,糖尿病及其并发症的治疗效果仍不理想,降低血糖的药物和保健食品是预防、改善糖尿病以及延缓并发症发生的重要措施之一。近十多年来,对多糖降血糖的研究越来越多,动物实验研究：认为多糖降血糖的机制主要为以下几个方面：①改善胰岛细胞形态和功能,促进胰岛素分泌；②提高胰岛素敏感性；③改善糖代谢,促进肝脏、肌肉等外周组织和靶器官对糖的利用；④调节自身免疫,清除自由基,降低血糖；⑤改善糖代谢相关酶活性；⑥减缓胰岛素在体内的代谢；⑦抑制α葡萄糖苷酶活性,延缓葡萄糖吸收。桃胶(peach resin)是桃树(蔷薇科植物)的树干受机械损伤(如虫咬、切伤等)或致病后分泌出来的胶质半透明物质。其主要成分是多糖、蛋白质等,其他物质含量极少。其多糖由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等成分组成。不同产地、不同作者所报道的桃胶单糖种类及其含量有较大差异。造成这种差异的原因,可能与桃胶品种、产地的差异有关。目前对桃胶理化性质的认识还不够,如桃胶多糖的分子量、分子结构、溶解度、亲水亲油平衡值、临界胶束浓度、流变类型、表面张力等理化性质。丁婷等用桃胶粉给四氧嘧啶糖尿病大鼠灌胃研究发现桃胶能提高糖尿病大鼠胰岛素水平,降低血糖,同时还能降低低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和总胆固醇,且呈一定的量效关系。洪郁之等将30g原桃胶与2两馒头给予30例糖尿病患者同时食用后,受试病人受试日餐后各时点血糖值以及葡萄糖曲线下面积均明显低于对照日,认为原桃胶的这种降血糖作用与其他植物膳食纤维作用机理类似。即原桃胶延缓肠道对糖的吸收,导致胃抑多肽分泌减少,血中胰岛素水平下降。由于桃胶在改善餐后糖耐量的同时,不增加血胰岛素水平,故不但不加重胰岛素抵抗的2型糖尿病患者高胰岛素血症,而且可减少糖尿病患者胰岛素或口服降糖药的剂量。我国桃胶资源丰富,分布广泛,广东、河北、陕西、甘肃、江西、江苏省等均是桃胶的产地。桃胶产量大,价格便宜,约为2500元/吨。桃胶多糖降糖的研究可以为开发新的降糖药物和保健品提供理论依据。本文利用水提醇沉的方法提取桃胶多糖,观测不同分子量的桃胶多糖降糖效果,对淀粉酶、蔗糖酶、麦芽糖酶等消化酶的影响,研究桃胶多糖可能的降糖机制。2.研究方法2.1.多糖的提取、分离新鲜桃胶去杂、漂洗后进行冷冻干燥、磨碎,90℃热水浸提,Sevage法脱蛋白。采用梯度醇沉法,在上述脱蛋白糖液分次加入无水乙醇至50%、70%、90%沉淀,分别离心取沉淀,得到三种粗桃胶多糖。三种粗桃胶多糖经葡聚糖凝胶层析柱进一步纯化。2.2.实验动物模型建立选用SD大鼠80只,雄性,180-220g,自由饮食和饮水,适应1w后将大鼠随机分成正常组(10只)和造模组(70只)。实验期间正常组用基础饲料喂养,造模组以高糖饲料喂养。造模组禁食(不禁水)12h,用生理盐水将四氧嘧啶配制成新鲜的2%四氧嘧啶溶液(注意冰上避光操作,防止分解),按剂量120、80、60mg/kg对造模组大鼠间断进行三次腹腔注射,自由饮食饮水72h后,测禁食12h空腹血糖,挑选血糖值在11.1～k25mmol/L之间者为糖尿病模型大鼠,并将其随机分为5组：空白对照组、阿卡波糖组、桃胶多糖低分子量组、桃胶多糖中分子量组、桃胶多糖高分子量组,每组8只。2.3.桃胶多糖降血糖的研究(1)不同分子量桃胶多糖及阿卡波糖对DM模型大鼠空腹血糖、餐后血糖的影响(2)不同分子量桃胶多糖及阿卡波糖对DM模型大鼠胰岛素、C肽的影响2.4.桃胶多糖被消化酶分解实验研究2.5.桃胶多糖对消化酶影响的实验研究(1)桃胶多糖和阿卡波糖对淀粉酶活性影响的实验研究。(2)桃胶多糖和L-阿拉伯糖对蔗糖酶活性影响的实验研究。(3)桃胶多糖对麦芽糖酶活性影响的实验研究。2.6.统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,主要采用独立样本t检验和方差分析。当方差齐时组间比较采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),当方差不齐时用近似F检验的Welch法,并以最小显著差异法(LSD法)或Dunnett’T3法进行各组间的两两比较。以a=0.05为检验水准。3.结果3.1.桃胶多糖的提取、分离通过采用热水浸提、Sevage法脱蛋白、乙醇分级沉淀的方法得到三种不同分子量的桃胶多糖,所得桃胶多糖经葡聚糖凝胶层析柱纯化,干燥后状态为灰褐色固体粉末,得率为29.8%。3.2造模后大鼠情况正常大鼠精神状况良好,饮食、饮水及大小便正常,活动正常,反应灵敏,背毛平伏、浓密而有光泽,体重增长明显。造模组大鼠在实验期间均出现明显得多饮、多食、多尿症状,且尿中出现白色絮状样油脂,精神较为萎靡,活动稍少,体毛偏黄,少光泽。实验期间造模大鼠出现3只死亡。造模后大鼠的空腹血糖经Levene检验方差不齐(F=3.350,P=0.012),各组间大鼠空腹血糖比较有显著差异(F=46.484,P=0.000)；Dunnett T3检验,正常组与造模组有显著差异(P<0.01),造模后大鼠的餐后血糖经Levene检验方差齐(F=1.489P=0.214),各组间大鼠的餐后血糖比较均有显著差异(F=54.771,P=0.000),采用LSD检验,正常组与造模组间有显著差异(P<0.01)。3.3桃胶多糖被消化酶(淀粉酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶)分解实验实验证实桃胶多糖不能被淀粉酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶等分解。3.4不同分子量桃胶多糖及阿卡波糖对DM模型大鼠血糖的影响给予桃胶多糖治疗2周后,与模型组比较,给药组DM大鼠体毛色泽较光亮,精神较前好转,活动较多,反应较为灵敏。各组间空腹血糖比较有显著差异(F=19.428,P=0.000),需进一步进行组间的两两比较。模型组空腹血糖显著高于正常组(P<0.01)；桃胶多糖各分子量组与阿卡波糖组空腹血糖比较无显著差异(P>0.05)；桃胶多糖各分子量组与模型组比较,空腹血糖有显著差异(P<0.01),与正常组比较也有显著差异(P<0.05),说明桃胶多糖可以降低DM模型大鼠空腹血糖,降糖效果与阿卡波糖相似。各组间餐后血糖比较有显著性差异(F=44.996,P=0.000),需进一步进行组间的两两比较。模型组餐后血糖显著高于正常组(P<0.05)；桃胶多糖各分子量组与阿卡波糖组餐后血糖无显著差异(P>0.05)；桃胶多糖各分子量组及阿卡波糖组餐后血糖与模型组比较有显著差异(P<0.05)；与正常组比较餐后血糖也有显著性差异(P<0.05)。说明桃胶多糖可以降低DM模型大鼠餐后血糖,降糖效果与阿卡波糖相似。3.5不同分子量桃胶多糖及阿卡波糖对DM模型大鼠胰岛素、C肽的影响各组间胰岛素比较(F=0.995,P=0.443),各组间C肽比较(F=2.276,P=0.064),各组间无显著性差异,无需进行两两比较。说明桃胶多糖不能直接改善胰岛D细胞功能。3.6桃胶多糖对消化酶影响试验3.6.1桃胶多糖及阿卡波糖对淀粉酶活性影响的动物实验桃胶多糖、阿卡波糖分别和淀粉溶液混合、单纯淀粉溶液3组分别给正常大鼠灌胃后0,10,30,60,90,120分钟检测6个时点血糖,3组溶液对正常大鼠餐后血糖影响有显著差异(P=0.000)；组间两两比较(LSD法),桃胶多糖组、阿卡波糖组分别与单纯淀粉组比较,餐后血糖各个时点均有显著差异(P=0.000),桃胶多糖组与阿卡波糖组餐后血糖比较无显著差异(P=0.239),说明桃胶多糖能够降低血糖,降糖效果与阿卡波糖相似,其的降低血糖机制是通过抑制淀粉酶活性,进一步延缓碳水化合物的吸收,达到降低餐后血糖的作用。3.6.2桃胶多糖及L-阿拉伯糖对蔗糖酶活性影响的动物实验桃胶多糖、L-阿拉伯糖分别和蔗糖溶液混合、单纯蔗糖溶液3组分别给正常大鼠灌胃后0,10,30,60,90,120分钟检测6个时点血糖,3组溶液对正常大鼠餐后血糖影响无显著差异(P=0.151)；说明桃胶多糖、L-阿拉伯糖对蔗糖酶没有抑制作用,当动物摄入以蔗糖为主的食物,桃胶多糖没有降低血糖的作用。3.6-3.桃胶多糖对麦芽糖酶活性影响的动物实验桃胶多糖和麦芽糖溶液混合与单纯麦芽糖溶液2组分别给正常大鼠灌胃后0,10,30,60,90,120分钟检测6个时点血糖水平,2组溶液对正常大鼠餐后血糖影响有显著差异(P=0.002)；说明桃胶多糖对麦芽糖酶具有一定的抑制作用,其降糖机制是通过抑制麦芽糖酶活性,进一步延缓碳水化合物的吸收,达到降低餐后血糖的作用。4.研究结论1.桃胶多糖不能被人体主要消化酶分解,即不能在胃及小肠内分解和吸收进入血液循环。2.不同分子量的桃胶多糖均可以降低DM模型大鼠空腹及餐后血糖,降糖效果与阿卡波糖无差异,但对胰岛素及C肽无影响。说明桃胶多糖不能直接改善胰岛功能,而是通过影响糖的分解或者单糖的吸收降低血糖的。3.桃胶多糖能抑制淀粉酶、麦芽糖酶活性,说明桃胶多糖的降低血糖机制是通过抑制消化酶,进一步延缓碳水化合物的吸收,达到降低餐后血糖的目的。4.由于阿卡波糖仅仅能抑制淀粉酶活性,不能抑制麦芽糖酶,本研究显示,桃胶多糖不仅可以抑制淀粉酶,而且也能抑制麦芽糖酶,所以,对进一步寻找桃胶多糖分子中抑制淀粉酶、麦芽糖酶活性的功能基团,开发消化酶抑制剂的降低血糖药物提供了理论依据。5.桃胶多糖不抑制蔗糖酶活性,当动物摄入以蔗糖为主的食物,桃胶多糖没有降低血糖的作用。6.本研究应用桃胶多糖的量明显高于阿卡波糖,但桃胶多糖产量高,成本低,上述研究结果为桃胶多糖进一步开发成降低血糖的保健食品,提供了理论依据。