目的： 异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)是目前根治白血病、骨髓增殖异常综合症、淋巴瘤等恶性血液系统疾病和重型再生障碍性贫血，以及某些遗传性疾病、免疫缺陷病、自身免疫性疾病的最有效方法之一。排斥、移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)与感染是其主要合并症，三者中尤以后二者最为突出。因为感染常在GVHD和治疗GVHD所继发的免疫功能低下的基础上发生，所以，实际上因供受者主要或次要组织相容性抗原(majororminorhistocompatibilityantigen，MHC/mHC)存在差异而引起的GVHD是allo-HSCT最主要的合并症，亦是影响移植成败的关键问题。 本研究旨在探讨一条降低GVHD而又保留GVL效应的移植新途径，为诱导allo-HSCT的免疫耐受提供新的方法。 本研究以单相混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)为反应体系，体外模拟allo-HSCT，在同种异体正常反应T细胞存在下，体外联合应用TJU103和CTLA4-Ig分别阻断同种异体反应性T细胞活化的抗原识别信号和共刺激分子信号途径，通过检测供者T细胞的增殖和细胞毒活性、免疫和克隆表型以及分泌细胞因子的浓度探讨：①二者联合应用能否诱导对以接触的抗原产生耐受；②如果能诱导免疫耐受，其可能的机制；③是否影响对白血病细胞的杀伤效应。 实验方法： 第一部分：人T细胞克隆分析技术和TCR基因重排方法的建立 1.设计并合成人TCRαβT细胞26个TCRBV(TCRβchainvariablegene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCRBC(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物(带FAM标记)：设计并合成人34个TCRAV(TCRαchainvariablegene，TCRAV)家族的上游引物和共用的TCRAC(TCRαchainconstantgene，TCRAC)的下游引物(内侧端引物带FAM标记)；在人TCRBC基因中合成实验对照的TCRBC1、TCRBC2上游引物。分别以T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和Burkitt淋巴瘤细胞株Raji作为阳性和阴性对照，以正常健康人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)和正常分娩的脐血单个核细胞(cordbloodmononuclearcell，CBMC)为研究样本，提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增并用1.5％琼脂糖凝胶检测24个TCRBV基因家族和32个TCR基因家族包含完整CDR3区段的cDNA，采用6％测序胶基因扫描分析单克隆水平Jurkat细胞和群体多克隆水平正常人PBMC中TCRαβT细胞α和β链的CDR3基因谱系多态性和长度分布，建立稳定地监测TCRαβT细胞克隆分析技术。 2.根据TCR基因有效重排时参与因素的复杂性，选取TCR基因剪切和连接(非同源末端重组系统，non-homologousend-oiningmachinery，NHEJ)的主要调控蛋白：重组酶激活基因酶(RecombinationActivatingGene，RAG)、末端脱氧核糖核酸转移酶(terminaldeonucieotidyltransferase，TdT)、Ku70和Ku80连接蛋白为研究对象，设计合成各蛋白基因上下游引物。以胸腺组织，Jurkat细胞和正常人的PBMC为研究对象(可分别作为本研究的阳性、阴性对照。参照文献和本校分子免疫学研究所的研究，Jurkat细胞的重排体系是开放的，可与胸腺一起作为阳性对照)，提取各样本总RNA，逆转录聚合酶链式反应(reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR)检测其mRNA的表达，并对产物进行鉴定。 第二部分：TJU103联合CTLA4-g诱导供者T细胞的免疫耐受 常规分离正常人PBMC12份，等分成6份，分别作为供者和受者，以供者的PBMC作为反应细胞，MMC处理分成的PBMC作为受者刺激细胞，体外建立模拟allo-HSCT供、受者间的单相混合淋巴细胞反应MLR体系，分成TJU103组、CTLA4-Ig组、联合组，分别加入25mg/L的TJU103、15mg/L的CTLA4-Ig、等浓度的TJU103和CTLA4-Ig，设单纯对照组，进行5天标准的单相MLR。分别应用四甲基偶氮唑蓝(memylthiazolyltetrazolium，MTT)还原法和LDH释放法检测供者淋巴细胞的增殖活性以及不同效靶比时供者淋巴细胞对受者PBMC和KG1a细胞的细胞毒活性。 第三部分：TJU103联合CTLA4-Ig体外诱导供者T细胞免疫耐受的机制 用流式细胞仪检测单相MLR后供者淋巴细胞中CD4+T、CD25+T、CD40L+T、CD8+T细胞的百分率，用酶联免疫吸附法(enzyme-labeledimmunosorbentassay，ELISA)检测T细胞分泌的细胞因子：转化生长因子(tmsforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)、干扰素γ(interferonγ，INF-γ)和白细胞介素-4(interleukin，IL-4)的浓度，应用基因扫描技术和RT-PCR分析T细胞克隆的变化和TCR基因重排调控蛋白mRNA的表达情况，以探讨其诱导免疫耐受的机制。 第四部分：TJU103联合CTLA4-Ig应用对T细胞细胞毒效应的影响 第一章 肿瘤细胞诱导同种异体外周血T细胞克隆增殖 常规分离正常人PBMC6份，将人急性髓系白血病细胞KG1a和人神经胶质瘤细胞U251经丝裂霉素C(mitomycin，MMC)处理(MMC处理组)或反复冻融制备成细胞溶解物Lysate(Lysate组)后，进行混合淋巴/月中瘤细胞培养(mixturelymphocyte/tumorcellcluture，MLTC)。应用流式细胞技术、MTT还原法和乳酸脱氢酶(LDH)4小时释放法分别检测诱导后增殖T细胞免疫表型、增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤活性；分别应用基因扫描技术和RT-PCR分析T细胞克隆的变化和TCR基因重排调控蛋白mRNA的表达情况。 第二章 TJU103联合CTLA4-Ig应用对T细胞细胞毒效应的影响 取上述单相MLR后的供者PBMC作为反应细胞，加入KG1a细胞Lysate进行5天MLTC。应用MTT还原法、流式细胞技术和LDH释放法分别检测供者T细胞的增殖活性、免疫表型和对KG1a细胞的细胞毒活性，同时应用基因扫描技术和RT-PCR分析T细胞克隆的变化和TCR基因重排调控蛋白mRNA的表达情况。 第五部分：单倍型造血干细胞移植前后T细胞克隆变化的初步研究 选取2例进行hap-HSCT的白血病患者，以供者、移植前后受者的PBMC为研究样本，监测TCRAV和TCRBV家族克隆表达的动态变化，CDR3克隆性质及测定各家族的利用率，观察其与受者免疫功能重建和GVHD的关系。同时检测供者NK细胞的KIR分型和受者的HLA基因型，观察其与移植后患者生存状况的关系。 统计学方法： 应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，实验数据以均值±标准差(x±s)表示，以析因设计资料方差分析比较各组间的杀伤率和T细胞增殖抑制率的差异，以LSD与SNK法进行组间比较。以单因素方差分析比较细胞因子浓度、T细胞增殖率、CD4+CD25+T细胞和CD40L+T细胞的百分率的差异，采用独立样本t检验进行组间比较。以P<0.05表示差异有显著统计学意义。 结论： 1.基因扫描分析人TCRαβT细胞CDR3基因型是一种简便、可靠、灵敏度高的T细胞克隆检测技术，可用于肿瘤、造血干细胞移植、自身免疫性疾病等的T细胞应答机制方面的研究。 2.RT-PCR检测NHEJ中的几种主要调控蛋白RAG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdTmRNA表达的方法稳定、可靠，可作为研究TCR异常重排机制的技术平台。 3.TJU103联合CTLA4-Ig通过降低供者T淋巴细胞对受者正常组织抗原的增殖能力和细胞毒活性诱导移植免疫耐受，其不影响供者淋巴细胞的抗白血病效应。其诱导免疫耐受的机制可能与上调Th2细胞比率，阻断CD4+和CD8+T淋巴细胞之间的协同效应，诱导出免疫耐受的T细胞克隆有关。 4.肿瘤细胞和肿瘤细胞溶解物均可在体外诱导出同种异体特异性CTL，该CTL细胞可能为优势表达的对肿瘤应答的TCRAV和TCRBV家族克隆T细胞。TJU103联合CTLSA-Ig不影响供者淋巴细胞的抗白血病效应。 5.T细胞克隆分析技术可以用于动态监测allo-HSCT后受者的免疫功能；还可以用于寻找介导GVHD和特殊感染的T细胞克隆。此外，供者KIR基因型和受者HIA基因型错配可以用于择优选择合适的供者。 本研究的创新点： 1.在抗原存在的条件下，首次通过同时调节同种异体反应性T细胞活化的HLA/p-CD4和B7-CD28/CTLA4信号传递途径诱导免疫耐受，并且不影响T细胞对白血病细胞的细胞毒活性。 2.首次从T细胞克隆和TCR二次重排角度认识T细胞的免疫耐受和二次反应。