肝纤维化被认为是一种急慢性各种致病因子导致的肝细胞弥漫性损伤的病理过程,在其过程中细胞外基质（extracellμLar matrix,ECM）的过度积累是明显特征。静止的肝星状细胞（HSC）发生活化是肝纤维化过程中最重要的一步,分泌过多的α-SMA,是ECM的主要来源。酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）是一类由细胞外阳离子激活的离子通道,当细胞外酸化时,酸敏感离子通道开放,与此同时对Na⁺和Ca²⁺通透性增高,从而引起细胞中生理病理的变化。课题组前期实验结果研究表明在大鼠肝纤维化的肝星状细胞上存在ASIC1a的高表达,并参与肝星状细胞的活化过程,加速肝纤维化的发展进程。也有研究表明,ASIC1a与关节软骨细胞的焦亡密切相关,ASIC1a通道打开后,大鼠关节软骨细胞发生焦亡,加重风湿性关节炎的进程。焦亡是国内外学者关注的热点,其与肝纤维化也有密切联系,那么ASIC1a是否参与到活化的肝星状细胞焦亡过程中呢?为此,本次实验使用细胞外酸激活HSC-T6,探讨ASIC1a对其焦亡的影响极其可能的机制。本课题的研究内容包括以下4部分:1. 抑制、沉默和过表达肝星状细胞中的ASIC1a对肝星状细胞活性的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a特异性阻滞剂Pc TX1、转染ASIC1a-si RNA和ASIC1a过表达质粒干预,考察ASIC1a对HSC-T6细胞胞内细胞增殖及基质代谢的影响。MTT法观察ASIC1a阻滞剂Pc Tx-1预处理后对酸诱导HSC-T6的细胞增殖的影响,与p H6.0组相比,HSC-T6细胞生长明显被抑制。研究HSC-T6功能的影响,发现与p H7.4组相比,酸处理至p H6.0 HSC-T6细胞中α-SMA、Collagen-I表达增加,Pc Tx-1和ASIC1a-si RNA干预后α-SMA、Collagen-I表达降低,使用ASIC1a过表达质粒进行干预后,上述α-SMA、Collagen-I指标均增加。研究提示,ASIC1a参与HSCs功能和代谢过程,当酸刺激下,ASIC1a激活和通道开放,进而调节HSC-T6细胞生长和胶原分泌。2. 抑制、沉默和过表达ASIC1a对肝星状细胞中Ca²⁺内流的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a特异性阻滞剂Pc Tx-1、转染ASIC1a-si RNA和ASIC1a过表达质粒干预,考察ASIC1a对HSC-T6细胞胞内Ca²⁺浓度的影响。激光共聚焦显微镜、Ca²⁺成像研究HSC-T6胞内Ca²⁺的变化发现,p H6.0能明显促进Ca²⁺流入HSC-T6胞内,Pc Tx-1和ASIC1a-si RNA干预后内流程度降低,使用ASIC1a过表达质粒进行处理后,Ca²⁺内流明显均增加。研究提示,当酸刺激下,ASIC1a激活和通道开放,使HSC-T6细胞Ca²⁺内流增加。3. 抑制、沉默和过表达ASIC1a对活化的肝星状细胞焦亡的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a特异性阻滞剂Pc Tx-1、转染ASIC1a-si RNA和ASIC1a过表达质粒干预,考察ASIC1a对活化的HSC-T6焦亡的影响。研究结果显示,ASIC1a激活可影响HSC-T6焦亡相关指标ASC、caspase-1、NLRP3和GSDMD的表达。Pc Tx-1和ASIC1a-si RNA处理后,与模型组相比,焦亡相关指标的表达有所增加,ASIC1a过表达质粒干预后上述焦亡指标的表达有所降低。并且,LDH结果显示,抑制ASIC1a后,上清液中LDH含量较酸化组有所增高。此外,Elisa结果也表明,抑制或沉默ASIC1a后,培养基上清液中IL-1β和IL-18的含量有所升高。转染ASIC1a过表达预处理后上述焦亡相关指标则与上述叙述结果相反。研究提示,ASIC1a抑制细胞外酸诱导活化的肝星状细胞的焦亡。4. Ca²⁺对ASIC1a介导的肝星状细胞焦亡的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用无Ca²⁺培养基进行预处理,考察Ca²⁺对活化的HSC-T6焦亡的影响。研究结果显示,无Ca²⁺培养基进行预处理后,与模型组相比,焦亡相关指标的表达有所增加。研究提示,Ca²⁺抑制细胞外酸诱导活化的肝星状细胞的焦亡。综上所述,本次研究结果表明:在大鼠肝星状细胞中,酸诱导使其发生活化。在活化的肝星状细胞中,ASIC1a激活则抑制其焦亡,其可能机制是通过对Ca²⁺与炎症小体的调控作用的。