论文部分内容阅读
在核移植过程中,供体核(karyoplast)与受体胞质(cytoplast)是重构胚的两个重要组件,尤其后者对于促进核重塑及胚胎进一步发育至关重要。目前,人们主要是通过显微操作机械性的去除核染色质来获得受体胞质。但该方法却存在着技术要求高,耗费时间长,对细胞损伤大的缺点。近年来有人尝试应用化学试剂诱导去除卵母细胞染色质,简称诱导去核(IE,Induced-enucleation)。国外多家实验室对该方法进行了一系列的研究,但并未对影响诱导去核率的各因素作系统分析,且目前国内尚无相关报道。因此本研究的主要目的是优化脱羰秋水仙碱(Deme,Demecolcine)诱导去核程序,通过在昆明白小鼠上探索性的研究,为应用该方法进行大动物卵母细胞去核提供一定的资料和经验。在已有Deme诱导去核技术路线的基础上,以昆明白小鼠卵母细胞为实验材料,对影响去核率的几个因素(包括Deme浓度、Deme处理起始时间和作用时间、卵母细胞的卵龄)逐次进行实验。结果表明:激活卵母细胞在浓度为0.4 μg/mL和0.5 μg/mL Deme-KSOM液中处理60 min的去核率分别为27.3%、33.3%,二者之间差异不显著,但与0.6 μg/mL组(11.9%)相比差异显著。卵母细胞在0~5 min之内迅速放入0.5 μg/mL Deme-KSOM液中,处理60~180 min得到了相对较高的去核率(31.9%~24.5%)。且激活后0 min起始Deme处理并作用60 min获得了最高的去核率(31.9%),显著高于作用30 min时的去核率(11.5%),但与作用90 min、180 min的去核率(29.3%,28.5%)相比差异不显著。激活后10~15 min之内进行不同时间Deme处理均取得了相对较低的去核率(5.7%~12.0%)。卵龄为17~18 h的昆明白小鼠卵母细胞在激活后迅速放入0.5 μg/mL Deme-KSOM液中处理60 min,其去核率为27.1%显著的高于14~15 h和20~21 h组(7.3%,14.1%)。依据优化的Deme诱导去核程序进行了小鼠卵丘细胞核移植初探。重构胚在各时期的发育率分别为:卵裂率为12%(9/78),桑葚胚/囊胚率为2%(2/78)。本研究在国内首次进行了脱羰秋水仙碱诱导昆明白小鼠卵母细胞去核的研究,建立了优化的Deme诱导去核程序并应用该方法辅助进行了小鼠体细胞克隆的探索。