论文部分内容阅读
细胞膨胀致死毒素（Cytolethal distending toxin,CDT）是副猪嗜血杆菌重要毒力因子,但其致病机理尚不清楚。为揭示副猪嗜血杆菌CDT对猪上皮细胞损伤的机制,本研究以新生仔猪气管上皮细胞（Newborn piglet tracheal cell,NPTr）为模型,通过蛋白质表达及纯化、流式细胞术、q RT-PCR、Western Blot、CRISPR/Cas9等方法探究了LRRC8A在副猪嗜血杆菌CDT诱导NPTr细胞凋亡中的作用,主要研究内容如下:1. 成功表达并纯化了副猪嗜血杆菌Cdt A、Cdt B、Cdt C,并将其与NPTr细胞进行相互作用,结果显示:Cdt ABC可以诱导NPTr细胞发生凋亡,且呈现显著的剂量依赖性（P<0.001）,同时p53通路中p53、p-p53及促凋亡因子BAX表达显著上调（P<0.01）,抑凋亡因子Bcl-2显著下调（P<0.001）,凋亡执行者caspase 3活性显著升高（P<0.001）,说明Cdt ABC诱导NPTr细胞凋亡可能依赖p53途径。2. 为探究体积调节阴离子通道（Volume regulated anion channel,VRAC）是否在Cdt ABC诱导NPTr细胞凋亡过程中发挥作用,使用VRAC阻断剂PPQ-102和NS3728。结果显示:PPQ-102和NS3728可使NPTr细胞免于Cdt ABC诱导的细胞凋亡（P<0.001）,可显著降低p53通路中p-p53、p53及促凋亡因子BAX的上调表达（P<0.001）及凋亡执行者caspase 3活性的增加（P<0.001）。此结果说明,VRAC阻断剂PPQ-102、NS3728可使NPTr细胞免于Cdt ABC诱导的细胞凋亡,并初步提示VRAC可能在Cdt ABC诱导NPTr细胞凋亡中发挥关键作用。3. 为探索组成VRAC的LRRC8家族五个蛋白LRRC8A–E是否在Cdt ABC与NPTr细胞相互作用中发挥作用,经q RT-PCR检测发现:LRRC8家族中五个蛋白LRRC8A–E的转录水平随不同浓度的Cdt ABC发生了显著的上调表达（P<0.01）,这一结果说明LRRC8家族参与到Cdt ABC与NPTr细胞相互作用的过程中。4. 因LRRC8A是组成VRAC的必需亚基,使用LRRC8A小干扰RNA（LRRC8A si RNA）针对目的基因进行瞬时敲低。结果显示:LRRC8A si RNA后可显著降低p53通路中p-p53、p53及促凋亡因子BAX的上调表达（P<0.01）及凋亡的执行者caspase3的活性的增加（P<0.001）。以上结果说明,瞬时敲低LRRC8A可降低Cdt ABC诱导的NPTr细胞凋亡,提示LRRC8A可能在Cdt ABC诱导NPTr细胞凋亡中发挥关键作用。5. 使用CRISPR/Cas9技术稳定敲除LRRC8A,获得LRRC8A–/–细胞株。LRRC8A–/–细胞可显著降低Cdt ABC诱导的NPTr细胞凋亡（P<0.001）,显著降低p53通路中p-p53、p53及促凋亡因子BAX的上调表达（P<0.001）及凋亡的执行者caspase3活性的增加（P<0.01）。除此,LRRC8A–/–的rescue细胞株可有效恢复Cdt ABC诱导NPTr细胞p53依赖的凋亡,以上结果说明,稳定敲除LRRC8A可降低Cdt ABC诱导的NPTr细胞凋亡,进一步证明LRRC8A在Cdt ABC诱导NPTr细胞凋亡中发挥关键作用。通过使用阻断剂PPQ-102、NS3728对LRRC8A进行非特异性的阻断,及使用LRRC8A si RNA针对目的基因Knockdown和使用CRISPR/Cas9技术针对目的基因Knockout,这三种方法均可以显著降低Cdt ABC诱导的NPTr细胞凋亡,且在LRRC8A–/–NPTr细胞中重新表达LRRC8A可有效恢复Cdt ABC诱导的NPTr细胞凋亡,以上结果初步说明LRRC8A在副猪嗜血杆菌Cdt ABC诱导NPTr细胞p53凋亡的过程中发挥关键作用,并为今后LRRC8A在其他革兰氏阴性菌的Cdt ABC诱导靶细胞凋亡的研究中提供参考。