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目的:以我国最常见的肾脏病病理类型IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）作为研究对象,引入“补肾络、清肾络、消肾络”的中医“络病”理论,探索“补、清、消肾络”的芪蓟肾康汤在其中的治疗作用及其与ERK通路、MCP-1、NF-kB细胞因子之间的关系。利用转基因方法构建并评价一种新的自发性IgAN小鼠模型并进行体内实验、人肾小球系膜细胞进行体外实验,从分子和细胞水平观察不同药物浓度的芪蓟肾康汤对IgAN的作用情况,阐明IgAN病变的现代生物学机制,揭示IgAN“肾络病”理论的科学内涵。材料与方法:1、转基因IgAN动物模型造模方法及评估:与中国医学科学院医学实验动物研究所合作完成IGHA1基因定制、突变制作、载体构建、载体纯化、显微注射、胚胎移植、首建鼠基因型鉴定等工作,构建并评价IGHA1突变的转基因IgAN小鼠,标记为IGHA1-mut组,转基因小鼠背景品系为C57BL/6J。2、转基因小鼠的饲养、繁育及鉴定:（1）饲养:IGHA1-mutF0代种鼠引入后,饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级实验室中,内部环境洁净、有风压,温度保持在20-25℃,相对湿度维持在30%-50%,噪音<60dB,饲养室内每天紫外灯照射杀菌两小时,定期进行清洁消毒;饲料为60Coγ射线灭菌的无菌全价营养颗粒料,怀孕及生产雌鼠喂少量鸡蛋黄或葵花籽,不定时填料保证饲料充足。饮用水为纯净水装瓶后高压灭菌,每周换水2-3次,饮水连续不断;垫料使用无菌混合木屑或玉米芯;高压灭菌小鼠饲养笼饲养;鼠笼和垫料随时更换,保持清洁无菌;密切观察小鼠饮食、活动,记录环境数据和小鼠状况。（2）繁育:小鼠初配的适龄期为6090天。F0代IGHA1-mut转基因小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠配种,雌性IGHA1-mut小鼠的与野生型雄鼠交配（1:1）,雄性IGHA1-mut小鼠的与野生型雌鼠交配（1:2）,置单笼分娩、哺乳、离乳。F1代仔鼠发育好,哺乳期到23天,然后雌雄分开。同时做好记录。（3）阳性鼠筛选:F1代仔鼠23天剪取尾尖进行组织DNA提取及基因型鉴定,从F1代中筛选出基因型阳性的小鼠。3.转基因转基因IgAN动物模型评价方法:IGHA1-mut基因型组F1代小鼠分别于8周龄、12周龄、24周龄分别收集尿样进行性状观察,取肾脏组织进行IgA免疫荧光染色和H-E染色、六胺银染色、MASSON染色及PAS染色以评估异常免疫复合物沉积情况和肾脏组织学变化;眼球采血分离血清,检测IgA水平。每个时间点均设同龄同品系野生型小鼠作为对照组（n=6）。4.芪蓟肾康汤对IgAN小鼠治疗肾小球硬化的疗效评价及量效关系:C57BL/6J野生型小鼠为空白组;IGHA1-mut基因型转基因IgAN小鼠为模型,分为空白组、模型组、西药组（替米沙坦组）、芪蓟肾康汤高、中、低剂量组。各组灌胃后分别于14天、21天、28天为时间节点,观察小鼠的一般状态;观察尿液性状;采用组织形态学方法观察小鼠肾组织形态学改变;PCR、Western-blot、ELISA法检测ERK1/2、pERK1/2、MCP-1、NF-kB基因及蛋白表达情况,通过对比各组数据结果,评价芪蓟肾康汤对IgAN小鼠的治疗作用及量效关系,探讨其理论基础。5.芪蓟肾康汤药理血清的制备:芪蓟肾康汤煎煮方法参照国家中医药管理局相关规定煎煮,由辽宁中医药大学附属医院煎药室制备。高、中、低各剂量组生药量分别为:中药高剂量组139.32g/（kg·d）;中药中剂量组46.44g/（kg·d）;中药低剂量组15.48g/（kg·d）。替米沙坦片研磨后用蒸馏水溶解成1mg/ml的药液。大鼠分为五组（n=8）,即西药组（替米沙坦组）,中药高、中、低剂量组和正常血清组。大鼠先适应性喂养3天,按2ml/100g的灌胃剂量分别予中药各剂量组及西药组灌胃,正常大鼠血清制备予生理盐水灌胃,每天1次,连续灌胃5天,末次给药后1 h进行无菌操作,麻醉后,腹主动脉采血并分离血清,室温静置2h,4℃3000r/min离心20min,取血清,并将含药血清置于56℃水浴箱中、水浴30min灭活处理。灭活血清过滤除菌分装,置于-20℃冰箱保存备用6.人肾小球系膜细胞的培养与分组:人肾小球系膜细胞（HGMC）接种于75cm2培养瓶中,加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,置于恒温37oC、二氧化碳含量5%的孵箱中贴壁生长,隔天换液,待细胞贴壁达到80%-90%融合时接种孔板。接种24孔培养板培养24h,空白组仍予10%小牛血清的RPMI-1640培养液,模型组予含AngⅡ的10%小牛血清RPMI-1640培养液,各药物干预组换含10%药理血清RPMI-1640培养液,继续培养48h、72h后,在不同时间点分别收集细胞悬液,先用PBS缓冲液润洗两次,再加1.5 mL胰酶消化45min,待显微镜下观察细胞出现边缘缩小、基本脱离瓶底时,加入完全培养液12mL终止消化,反复吹打瓶壁细胞,收集细胞悬液于15 mL离心管中,2000r/min离心10 min,吸出上清液,加入完全培养液,制成细胞密度为1.0×105mL-1细胞混悬液,备用。7.芪蓟肾康汤调控ERK信号转导通路对HGMC分子机制的影响:体外培养HGMC,应用AngII引起HGMC增殖,分为空白组、模型组（AngII组）、芪蓟肾康汤高中低剂量组、西药组（替米沙坦）。在药理血清作用24h、48h、72h时进行MTT检测,观察细胞增殖情况,依据MTT结果在药理血清作用48h、72h时进行基因、蛋白表达的检测:采用ELISA法检测ERK1/2、pERK1/2、MCP-1、NF-kB蛋白分泌水平;采用RT-PCR方法测定MCP-1、NF-kB的基因mRNA表达情况;采用western-blot法检测基因MCP-1、NF-kB的蛋白表达情况。通过对比各组数据结果,探讨芪蓟肾康汤治疗IgAN的作用机制和靶点。结果:1.IGHA1-mut转基因F1代小鼠于出生后23天剪取尾尖进行组织DNA提取,从F1代中筛选出基因型阳性的小鼠。F1代小鼠出生率、成活率、雌雄性别比例正常,PCR阳性率在40%-60%之间,符合遗传规律;于8周龄、12周龄、24周龄观察尿液情况未发现肉眼血尿、泡沫等;肾脏组织进行HE染色,IGHA1-mut组小鼠8周龄时可见轻度肾小球系膜细胞增生,12周龄及24周龄IGHA1-mut组可见明显增生的肾小球系膜细胞,系膜基质增多;免疫荧光染色后发现,12周龄与24周龄时IGHA1-mut转基因组阳性小鼠系膜区均出现明显颗粒状IgA沉积,符合IgAN病理改变;MASSON、PAS、六胺银染色均从不同角度证实了小鼠在8周龄时肾脏病理改变不明显,至12周龄时肾脏病理改变较明显,系膜区可见免疫复合物沉积,细胞外基质增多等特征性表现;24周龄时病理改变进一步加重,出现基底膜增厚,间隙增宽,但尚未累计肾间质;Western-blot法检测IgA蛋白表达,发现8周龄已经出现IgA蛋白表达量的异常升高,12周龄时IgA蛋白表达水平最高,24周龄维持在较高水平,参考模型评价结果,考虑在进一步IGHA1-mut转基因小鼠体内实验时选择12周龄小鼠进行。2.选用IGHA1-mut基因型阳性的F1代小鼠作为动物模型进行体内实验,依实验一结果,小鼠12周龄时开始给药,分别在14天、21天、28天时采集样本,通过IgA免疫荧光染色、HE染色、MASSON染色、PAS染色、六胺银染色、PCR、western-blot及血清ELISA检测方法,从不同角度观察小鼠肾脏组织、细胞因子基因与蛋白及血清细胞因子分泌量的变化情况。IgA免疫荧光结果显示:正常组荧光亮度阴性,模型组荧光亮度强阳性,提示明显IgA沉积,是IgAN的主要诊断指标。各时间点特殊染色结果提示:正常组肾小球结构正常,模型组肾小球肿胀、体积增大,可见弥漫性系膜增生,炎性细胞浸润,系膜基质增宽;MASSON染色可见红色点片状免疫复合物沉积;PAS可见免疫复合物沉积。而各组经西药组、芪蓟肾康汤高、中、低各剂量组干预后,均有不同程度的改善,可见芪蓟肾康汤具有很好的改善肾小球系膜细胞增生的作用;PCR结果显示:芪蓟肾康汤可显著抑制炎症因子MCP-1、NF-kB mRNA的表达;western-blot结果显示:对IgA蛋白的表达有显著的抑制作用;ELISA结果可见,芪蓟肾康汤各剂量组可增加ERK1/2分泌量,抑制pERK1/2活化,减少pERK1/2分泌,从而达到调控ERK通路防治肾小球硬化的作用,且中药各剂量组存在量效关系。3.体外培养HGMC,用AngII作为刺激因子使HGMC增殖,用芪蓟肾康汤药理血清作为干预因素,通过MTT、ELISA、PCR、western-blot检测方法探讨芪蓟肾康汤对各组细胞增殖的作用。实验MTT结果显示:在药理血清刺激24 h、48 h、72 h后,各时间点的模型组OD值较正常组显著升高,提示细胞增殖;药理血清干预后,各药物干预组OD值较模型组均明显减少,在48h、72h抑制细胞增殖的作用优于24h;选择48h、72h两个时间点观察ELISA检测结果:与正常组比较,AngII组pERK1/2表达显著升高,ERK1/2表达显著降低,NF-κB、MCP-1表达显著升高,说明pERK1/2被活化,同时ERK1/2表达降低,炎症因子MCP-1、NF-κB活化,芪蓟肾康汤干预后,与AngII组比较pERK1/2、NF-κB、MCP-1表达均减少,ERK1/2表达升高,各时间点均有显著差异;PCR、western-blot结果表明:体外培养的HGMC加入AngⅡ刺激后NF-κB、MCP-1 mRNA及蛋白表达明显升高;各组含药血清均能抑制经AngⅡ刺激后HGMC NF-κB、MCP-1 mRNA及蛋白的表达量。结论:1依据目前公认的IgAN发病机制,模拟人体IgA1分子铰链区结构的改变在IgAN发病过程中的作用,利用转基因方法成功构建并评价一种新的自发性IgAN小鼠模型——IGHA1-mut小鼠;IGHA1-mut小鼠在8周龄开始出现轻度细胞增生,至12周出现明显的肾脏病理改变,是一种造模成功率高、模型特征稳定可靠、接近人类IgAN发病机制的IgAN实验动物模型;IGHA1-mut转基因小鼠模型12周龄时IgAN肾脏病理组织学改变明显,直至24周龄时肾脏病理持续异常改变,故认为12周龄IGHA1-mut小鼠为最佳观察期。2通过体内实验阐明IgAN病变的现代生物学机制之一,与ERK磷酸化、过度分泌MCP-1、NF-kB细胞因子,诱发系膜细胞增殖和炎症反应有关;芪蓟肾康汤能有效地降低IgAN小鼠肾组织及血清中的IgA蛋白表达、调节ERK通路、抑制pERK活化、提高ERK含量、抑制下游炎症因子MCP-1与NF-kB基因及蛋白的表达,从而改善肾脏病理改变,减少肾小球系膜区的沉积,防止免疫损伤性肾小球疾病的进一步发展,对肾脏起到保护作用;芪蓟肾康汤通过调控ERK通路及相关因子达到延缓肾小球硬化的作用存在量效关系,且中药干预IgAN小鼠疗效较西药更加稳定持久,与临床应用中药治疗肾病4周为一疗程理论提供了理论依据;体现了以“补、清、消肾络”法为指导理论的芪蓟肾康汤可有效防止肾小球硬化进一步发展,对肾脏起到保护作用;3通过体外实验证实芪蓟肾康汤能有效抑制AngⅡ诱导的HGMC细胞外基质——FN的过度表达,抑制系膜细胞增殖,延缓肾脏损伤。芪蓟肾康汤能有效的抑制ERK信号转导通路的活化,通过抑制pERK1/2,提高ERK表达来平衡ERK通路的正常转导,抑制炎症因子NF-κB、MCP-1的活化,减少细胞炎症反应,减少细胞外基质的过度积聚,减轻肾小球的损伤,对肾脏起到保护作用,揭示了芪蓟肾康汤延缓肾小球硬化的作用途径。