【摘 要】
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非洲猪癌（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的高度接触传染性疾病,感染家猪的死亡率可高达100%,该病给世界各国的养猪业和生态系统造成了巨大的经济损失。2018年首次在我国报道,给我国养猪业造成灾难性的打击,我国将该病列为一类动物疫病。近几年,虽然国内许多学者开展了 ASFV研究,但相关研究工
【基金项目】
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国家自然基金专项（编号:31941016）； 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心； 江苏高校优势学科建设工程项目；
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非洲猪癌（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的高度接触传染性疾病,感染家猪的死亡率可高达100%,该病给世界各国的养猪业和生态系统造成了巨大的经济损失。2018年首次在我国报道,给我国养猪业造成灾难性的打击,我国将该病列为一类动物疫病。近几年,虽然国内许多学者开展了 ASFV研究,但相关研究工具还比较缺乏。本研究将利用杂交瘤技术,研制可用于ASFV相关研究的特异性单克隆抗体,以提供可靠生物学试剂。p54蛋白是ASFV病毒基因E183L的产物,位于病毒内囊膜,是病毒主要结构蛋白之一,在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时起着十分重要的作用;恢复期猪的血清显示,p72、p30和p54是感染期间最具抗原性的三种蛋白质,针对p54的抗体最早出现在感染后第8 d,并在受感染动物的血液中持续存在数周;且有研究表明p54蛋白与抗体介导的病毒中和有关,这些特性使得p54蛋白成为ASFV血清学诊断最佳抗原靶点之一。本研究主要包括以下三部分内容:用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达ASFV-P54重组蛋白、通过重组蛋白免疫小鼠制备针对p54蛋白的单克隆抗体以及利用单抗开展识别ASFV-p54蛋白抗原表位的鉴定。1.杆状病毒系统表达ASFV-P54重组蛋白根据GenBank上发布的非洲猪瘟病毒E183L基因序列设计合成一对特异性引物,利用PCR技术扩增ASFV-p54基因并将其克隆至pFast-Bac-HTA真核表达载体上,重组质粒转座至DH10 Bac感受态细胞获得重组杆粒,之后利用Lipofectamine 2000转染Sf9细胞,结果获得重组杆状病毒rBacASFV-p54。间接免疫荧光（IFA）证明感染重组病毒的细胞表现出特异性荧光,Western blot分析验证该蛋白可与ASFV 阳性血清发生反应,分子量大小为25 kDa,与目的蛋白大小相符。这些结果表明杆状表达系统已经成功表达了 ASFV-P54重组蛋白。2.非洲猪瘟p54蛋白单克隆抗体的研制使用第一部分的重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术,将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与SP2/0融合,通过间接免疫荧光的方法进行筛选,最终获得10株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为 ASFV-p54-2D3、ASFV-p54-4E4、ASFV-p54-2A4、ASFV-p54-1H8、ASFV-p54-2C4、ASFV-p54-4B2、ASFV-p54-6F10、ASFV-p54-1D7、ASFV-p54-2C7、ASFV-p54-5H8,Western blot 和 IFA 结果显示,这 10 株单克隆抗体均能与ASFV发生特异性反应,而不与猪源其他病毒反应,说明研制的单抗特异性强。利用获得的杂交瘤细胞制备小鼠腹水,IFA测定效价,结果腹水效价均能达到1:6400-1:51200。3.单抗识别ASFV-p54蛋白抗原表位的鉴定以研究内容二中所制备的单克隆抗体ASFV-p54-2A4为研究对象,将p54蛋白基因组截短并连接pET-32a表达载体,构建原核重组质粒,通过在BL21大肠杆菌表达系统中表达截短蛋白,应用Western blot的方法确定单克隆抗体ASFV-p54-2A4所识别的最短抗原表位。结果表明,单克隆抗体ASFV-p54-2A4的抗原表位定位于94TTASVGKPVTG104。
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