家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)目前是二分DNA病毒科二分浓核病毒属的唯一病毒种,它主要在家蚕中肠柱状细胞内复制,致使柱状细胞的核膨大,并引起严重的空头性软化病,是导致家蚕死亡的主要病源之一。BmBDV属于单链线性的二分DNA病毒,基因组包括两个独立包装于衣壳中的单链DNA分子,其中VDl约6.6 kb,VD2约6.0 kb。VD2的两个开放阅读框(Open reading frame,ORF)分别编码非结构蛋白NS3及次要结构蛋白P133,调控p133基因表达的启动子称为P89。本实验室通过双荧光素酶系统研究P89启动子核心功能区域时,在P89启动子-143 nt至-268 nt区域内可能存在一沉默子元件,抑制了该启动子的活性。通过进一步的生物信息学分析和截短性实验分析,沉默子的范围被确定在-195 nt至-205 nt之间。本课题主要利用荧光素酶检测体系,缺失突变和凝胶阻滞EMSA等实验,对家蚕二分浓核病毒BmBDV P89启动子中可能存在的沉默子元件进行进一步的鉴定,分析其作用方式和机理。首先,利用双荧光素酶报告系统,在P89启动子原有序列的基础上去除nt205至nt195序列构建缺失型表达载体pGL3-ΔS~+-P89,并在此基础上将该序列克隆至P89启动子上游,构建瞬时表达质粒pGL3-U-ΔSp89。转染昆虫细胞后测定荧光素酶表达的变化情况,结果显示缺失nt205至nt195后P89启动子活性显著上调,将其异位补回后P89启动子恢复最初活性,说明BmBDV P89nt205-195序列确实具有沉默子的功能。为了研究BmBDV P89nt205-195沉默子是否具有启动子特异性,将该序列克隆至BmBDV ns1/ns2基因启动子P5和BmNPV早期启动子Pie1的上游,构建瞬时表达载体pGL3-S~+-P5和pGL3-S~+-Pie1。结果表明BmBDV P89nt195-205沉默子能抑制P5和Pie1的活性,且在昆虫细胞BmN和Hi5中都能下调报告基因的表达。对这个沉默子作用方式的研究表明,其负调控作用是不依赖于其插入方向及插入位点的,当这段序列以nt205-195或者nt195-205的方向分别插入目的基因启动子的上游或者报告基因的下游之后,均观察到对目的基因的转录表现出较为明显的抑制作用。因此,该沉默子没有启动子特异性,且不具有方向依赖性和位置依赖性。凝胶阻滞实验表明,Hi5细胞中存在一个与该沉默子相互作用的特异性蛋白或蛋白复合物,对于这个特异性蛋白的鉴定工作仍在持续中。利用重叠PCR定点突变沉默子序列,构建沉默子突变型荧光素酶报告质粒,双荧光素酶报告系统实验结果表明,突变该沉默子中的碱基序列“AAAATG”会显著降低沉默子的功能。EMSA实验表明突变该区域导致沉默子识别蛋白无法结合,进一步证明“AAAATG”是沉默子关键性碱基。总而言之,BmBDV P89nt205-195确实具有沉默子的功能,它能与特异的蛋白相互作用抑制基因的表达,这种抑制作用不依赖沉默子的位置和方向,也不具有启动子特异性,该元件的后六位碱基对沉默子功能是关键的。我们的研究有利于深入了解BmBDV基因的表达调控机制,并为利用该沉默子元件调控基因的表达打下了基础。