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背景与目的多型性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiform, GBM)，属于WHO胶质瘤分级中I-IV级中的IV级恶性脑肿瘤，是星形细胞肿瘤中恶性程度最高、发病率最高的恶性肿瘤。其病程进展迅速，预后差，其5年生存率小于5%。该病常见于60-80岁成年人，随着社会老龄化，其患病人数每年递增。
目前国内外尚无针对该肿瘤的理想辅助性治疗手段，2005年开始，临床对GBM的标准治疗方案是：手术切除、辅助放疗和替莫唑胺(temozolomide，TMZ)同步化疗的综合治疗方案。但GBM恶性程度高，侵袭性强，术后极易复发且难治，一部分患者对化疗药物TMZ产生耐受。在最近的临床发展中，几种靶向药物治疗GBM都没有显示出可以延长整体生存期。目前研究中，GBM表现出广泛的肿瘤内和患者间异质性，GBM中多个致癌信号通路激活，提示单一药物或“单一途径”靶向药物将无法有效治疗该疾病，故多药物联合使用仍然是潜在有效治疗方案，但目前常规化学治疗剂的多重使用导致耐药性和对非癌细胞的严重毒性。所以，多靶向低毒性的天然提取物成为未来GBM治疗的潜在药物。
广泛存在于天然植物如花生、葡萄、虎杖中的多酚类化合物白藜芦醇(resveratrol, Res )在体外和体内实验中表现出多效活性，其安全性和药代动力学已在多项研究中得到证明。虽然之前的研究表明Res较差的理化性质严重限制了其作为游离药物的用途，但随着近几年脂质体纳米材料研发的进展，可将Res装入脂质体中增强Res的理化特性，且通过脂质体表面修饰使其对肿瘤治疗具有靶向性，这使得Res这种小分子多靶标化合物成为肿瘤治疗的潜力药物之一。Res能够穿越血脑屏障，并且对正常脑细胞几乎没有毒性作用，在GBM和其他神经系统疾病的治疗中具有潜在的神经治疗价值。我们的前期研究发现，Res不仅通过Wnt、Notch、STAT3等多信号通路途径对皮肤癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多种肿瘤发挥其抗肿瘤活性，并且对GBM在体内和体外均表现出抗肿瘤效果。我们在体内实验研究发现，通过腰穿给药方式治疗大鼠原位移植RG2胶质母细胞瘤，Res可降低肿瘤生长速度和大小，延长平均存活时间。
Res是为肿瘤靶标酵母Sir2p的哺乳动物直系同源物sirtuin-1(SIRT1)的激动剂。在对人胶质瘤组织样品和细胞系中SIRT1的表达水平的研究中发现，SIRT1在人脑胶质瘤组织样品中比在相邻组织中高表达，SIRT1沉默可抑制GBM细胞生存能力和侵袭，抑制GBM细胞系U251中AMPK、SIRT1的表达可增加其凋亡发生。然而我们的研究发现，SIRH的小分子激动剂Res可明显抑制人胶质母细胞瘤细胞U251的生长，并诱导其发生凋亡。结合一些研究发现SIRH激活可诱导GBM细胞自噬，我们推测，多信号通路的关键分子SIRT1在不同GBM细胞中被Res激活可能发挥的生物学功能不同。我们的前期工作中同时也发现，不同的胶质母细胞瘤细胞系对Res的反应不尽相同，有些敏感，如人胶质母细胞瘤U251和大鼠胶质母细胞瘤RG2细胞系；而LN229等细胞则表现为不敏感甚至耐受，但SIRT1在LN229这个GBM细胞系中的影响未见报道。
SIRT1在细胞内的生物活性和多条细胞信号通路有关。细胞自噬作为维护细胞内稳态的机制之一，在不同类型肿瘤中对肿瘤细胞的命运影响不同，在GBM细胞中，有报道激活SIRH阻碍自噬和肿瘤细胞生长，另有研究认为SIRH激活可诱导GBM细胞自噬但自噬对细胞的生理调节并不影响激活剂对肿瘤细胞的抑制作用。然而，SIRT1的小分子激活剂Res是否可以通过激活SIRT1在GBM中发挥抗肿瘤效应的研究鲜见报道，并且不同GBM细胞系对Res敏感性的差异是否与SIRT1激活或与其诱导的细胞自噬发挥的细胞保护或者细胞毒性作用有关也未明确，对此科学问题的进一步探究，可有助于揭示Res作用于不同GBM细胞的药物靶点对抗肿瘤活性的影响，探讨敏感性差异的自噬相关机制，可阐明Res治疗GBM的药用价值，为临床对GBM分子类型分析及在此基础上的精准治疗提供实验依据和理论参考。同时针对临床GBM的分子诊断基础上进行精准治疗和联合用药提供基础资料，并对改善患者预后具有重要的意义。
为此，本研究以对Res敏感性不同的人胶质母细胞瘤细胞系U251和LN229为研究对象，分析Res对GBM自噬的影响以及在对Res敏感性不同的细胞系中的自噬活性差异，从SIRH相关的自噬信号通路的活化状态的角度，进一步分析导致Res敏感性差异的可能原因，探讨Res在不同GBM细胞中抗肿瘤活性不同的分子机制，以期为Res在胶质母细胞瘤临床治疗中的应用提供新的科学依据，并且为提高耐药肿瘤的治疗效果提供新的思路和理论补充。
具体研究内容包括：
(1 )比较Res对不同GBM细胞自噬的影响，探讨不同胶质母细胞瘤Res的敏感程度与细胞自噬活性的相关性。
(2 )建立Res处理后自噬流定点动态检测实验体系，分析Res在不同持续作用时间中对不同人胶质母细胞瘤细胞系自噬激活及自噬流的影响，进一步探究Res的抗肿瘤生物活性与不同人胶质母细胞瘤细胞中自噬活性的关系。
(3 )分析调控自噬相关信号通路中的关键因子在Res处理后持续作用的不同时间点的表达和动态变化情况，探讨Res诱导不同人胶质母细胞瘤细胞自噬在其抗肿瘤活性差异中的功能角色及其机制。
(4 )建立腰椎穿刺给药Res治疗大鼠原位颅内胶质母细胞瘤移植瘤模型，在证实该用药途径的有效性基础上，探讨自噬在Res体内抗胶质瘤中的作用。
材料与方法选取对Res敏感性表现有显著差异的人胶质母细胞瘤细胞系LN229、U251，将其培养于含有10°%胎牛血清的DMEM培养基的高通量细胞爬片培养皿中，使用100yMRes处理LN229和U25148小时，其间，在加药前(0min组)、加药后48h内不同时间点分别收集细胞爬片和细胞，通过免疫细胞化学染色、透射电子显微镜对自噬体的观察、免疫荧光等方法对Res诱导的细胞自噬进行检测，分析敏感性差异的两种人胶质母细胞瘤细胞系中Res诱导的细胞自噬活化状态和特点以及差异性；采用免疫细胞化学、免疫蛋白印迹(Western-blotting， TO)等方法，从分子水平检测两种人胶质母细胞瘤细胞系经Res处理前后以及不同的时间点细胞自噬相关因子的表达及自噬状态和变化规律，借助激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察细胞内与自噬相关的微观结构特点，探讨Res诱导的细胞自噬在胶质母细胞瘤敏感性差异中的功能角色。根据自噬关键基因动态变化的特点选择自噬通路的关键因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、NAD+-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1(SIRT1)进行免疫荧光核移位分析和随时间变化蛋白表达的变化，探讨Res诱导的不同人胶质母细胞瘤自噬动态变化及其对两者之间敏感性差异的影响的可能机制。
结果
1.Res有效抑制人胶质母细胞瘤U251生长，诱导细胞凋亡，但LN229则对其耐受。TUNEL实验结果显示Res处理后LN229不发生凋亡，而U251在24?48h出现凋亡。
2.Res可诱导人胶质母细胞瘤LN229和U251发生细胞自噬。ICC、Western-blotting、细胞免疫荧光结果均显示Res处理后，有自噬相关蛋白Beclin1及LC3的表达。
3.Res处理的U251较LN229细胞有更高的自噬活性。ICC、Western-blotting、细胞免疫荧光结果均显示，U251细胞中的Beclin1、LC3、p62表达更强。
4.自噬活性动态观察发现，Res诱发的U251自噬持续时间更长，Res处理后24h内各时间点均有Beclin1、LC3的表达，说明Res处理后24h内，U251细胞中的自噬处于激活状态。
5.Res诱导的自噬具有波动性特征，即在Res处理开始至1h，自噬体的形成呈增多趋势，随即从1h至8h前，自噬体减少，自噬活性减弱，但在8h、10h及12h，自噬活性再一次升高，自噬体的形成大量增多，从12h之后，到24h、48小时，自噬活性逐渐减弱。
6.Res在敏感性不同的两个细胞系LN229与U251中诱导发生的自噬流不同。Res在不敏感细胞系LN229细胞中早期(1h以内)诱导的自噬激活，随着处理时间的延续，自噬流不能顺畅进行，在1h后的时间点中未见LC3被激活，LC3-II的加工不能完成，只能在细胞质中形成大量的隔离膜样的多层膜结构，不能形成自噬体。在U251细胞中，Res在早期诱导自噬发生，自噬被激活之后随着处理时间的延长呈波状变化，在细胞中形成并累积大量的自噬体，随着自噬过度激活，自噬体累积增多，降解减少，于12?24h达到高峰。
7.Res通过调控自噬通路GAPDH/SIRT1调控胶质母细胞瘤细胞自噬的发生，从而引起细胞死亡或是生存的结局不同，诱导U251自噬性死亡。Res促进U251细胞质中GAPDH入核，激活核内SIRT1的表达，从而脱乙酰化核内LC3，促进核内LC3出核形成LC3-II。过度激活的自噬导致自噬流不通畅，自噬体大量累积于细胞内，致U251细胞自噬性死亡。Res处理后，LN229细胞中GAPDH主要表达于细胞质，核内SIRT1无活化，不能促进核内LC3出核形成LC3-II。
8.TUNEL实验结果显示，Res处理后LN229无凋亡发生；而U251在24?48h开始凋亡，发生凋亡的时间出现在24h，是发生在U251细胞内自噬过度被激活之后。Western-blotting、激光共聚焦显微镜观察(confocal)结果、透射电镜结果表现为12h?24h，U251自噬被过度激活，自噬体降解减少，大量累积于细胞内，细胞质内出现大量的空泡状结构。
9.Res处理后，LN229和U251细胞中均表达Beclin1，LN229细胞在1h内有LC3的表达和活化，1h后活化下降，并且LC3-II的加工不能进行，同时，代表自噬体降解的p62在LN229被Res处理前后表达非常弱。实验结果表明，Res处理LN229之后诱导自噬的发生，但是自噬流不通畅，LC3表达降低，并且LC3I不能有效被加工为LC3II，从而自噬体不能形成、成熟。Res处理后U251细胞中的自噬相关基因表达随着处理持续时间不同，有规律性的变化。处理后，beclin1表达增强，LC3的表达增强出现在处理后1h及处理后10h;LC3-II/LC3-I比值的增加出现在处理后40min、12h、24h；同时p62的表达在1h、10h、24h增强，3h、8h表达降低，表明Res处理后诱导U251细胞发生两次自噬活性的增强，分别于早期40min?1h，稍晚期10h?12h，早期发生的自噬流顺畅，p62降解，第二阶段自噬的过度激活导致自噬体累积增多，p62降解减弱。
10.体内实验中，Res通过激活GAPDH/SIRT1信号通路调控颅内原位脑胶质瘤细胞移植瘤的自噬活性。免疫组织荧光结果和Western-blotting结果显示，Res腰椎穿刺给药治疗大鼠之后，颅内胶质瘤内自噬相关基因Beclin1、LC3，LC3-II/LC3-I升高，免疫组织化学结构提示，GAPDH、SIRT1在细胞核内的表达增强。
结论：
1.Res有效抑制人胶质母细胞瘤U251生长并诱导其发生细胞凋亡，但LN229则对其耐受。
2Res可诱导胶质母细胞瘤U251和LN229发生不依赖Beclin1的非典型性细胞自噬，U251细胞内的自噬活性高于LN229。
3.Res诱导人胶质母细胞瘤U251和LN229自噬流的受阻表现不同，在LN229中，自噬流的受阻发生在细胞核内LC3不能活化有效被加工为LC3-II，从而影响自噬体的形成和成熟，自噬启动之后的自噬体形成和成熟不能完成。在U251细胞中，Res处理后较短时间内诱导其发生的自噬流通畅，而自噬流受阻发生在10h之后，表现为自噬体大量累积，降解减少。
4.Res对U251的抗肿瘤活性与之诱导的U251细胞发生的过度自噬有关。
5.Res通过自噬通路GAPDH/SIRT1调控胶质母细胞瘤细胞自噬的发生，从而引起细胞死亡或是生存的结局不同。Res可在对U251作用早期促进GAPDH向核内移动，激活SIRT1，从而脱乙酰化核内LC3，过度激活自噬，导致大量自噬体在细胞内的积聚，在晚期引发自噬性程序型细胞死亡和细胞凋亡发生。
6.LN229对Res的药物抵抗性主要表现在Res不能促使LN229细胞质中的GAPDH向核内移动，从而不能调控核内自噬关键蛋白LC3成熟并出核与隔离膜结构结合形成自噬体，这或许是LN229对Res抗性的可能原因之一。
7.体内实验中，Res通过激活GAPDH/SIRT1信号通路增强颅内原位脑胶质瘤细胞移植瘤的自噬活性，表现抗肿瘤活性。
综上，本研究结论：Res激活U251细胞中GAPDH并促进其入核激活核内SIRT1表达从而去乙酰化核内自噬相关蛋白使LC3-II成熟并出核参与自噬体形成，自噬的过度激活导致自噬体大量堆积在细胞内从而导致U251发生自噬性死亡和凋亡，而Res引发的过度自噬在LN229细胞中并未发生从而导致LN229对Res处理不敏感，这可能与Res不能激活LN229细胞中的GAPDH有关。
Res可以诱导GBM细胞LN229和U251发生不依赖Beclin1的非经典自噬，并通过激活GAPDH/SIRT1自噬通路调控不同GBM细胞系对Res的敏感性差异。
目前国内外尚无针对该肿瘤的理想辅助性治疗手段，2005年开始，临床对GBM的标准治疗方案是：手术切除、辅助放疗和替莫唑胺(temozolomide，TMZ)同步化疗的综合治疗方案。但GBM恶性程度高，侵袭性强，术后极易复发且难治，一部分患者对化疗药物TMZ产生耐受。在最近的临床发展中，几种靶向药物治疗GBM都没有显示出可以延长整体生存期。目前研究中，GBM表现出广泛的肿瘤内和患者间异质性，GBM中多个致癌信号通路激活，提示单一药物或“单一途径”靶向药物将无法有效治疗该疾病，故多药物联合使用仍然是潜在有效治疗方案，但目前常规化学治疗剂的多重使用导致耐药性和对非癌细胞的严重毒性。所以，多靶向低毒性的天然提取物成为未来GBM治疗的潜在药物。
广泛存在于天然植物如花生、葡萄、虎杖中的多酚类化合物白藜芦醇(resveratrol, Res )在体外和体内实验中表现出多效活性，其安全性和药代动力学已在多项研究中得到证明。虽然之前的研究表明Res较差的理化性质严重限制了其作为游离药物的用途，但随着近几年脂质体纳米材料研发的进展，可将Res装入脂质体中增强Res的理化特性，且通过脂质体表面修饰使其对肿瘤治疗具有靶向性，这使得Res这种小分子多靶标化合物成为肿瘤治疗的潜力药物之一。Res能够穿越血脑屏障，并且对正常脑细胞几乎没有毒性作用，在GBM和其他神经系统疾病的治疗中具有潜在的神经治疗价值。我们的前期研究发现，Res不仅通过Wnt、Notch、STAT3等多信号通路途径对皮肤癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多种肿瘤发挥其抗肿瘤活性，并且对GBM在体内和体外均表现出抗肿瘤效果。我们在体内实验研究发现，通过腰穿给药方式治疗大鼠原位移植RG2胶质母细胞瘤，Res可降低肿瘤生长速度和大小，延长平均存活时间。
Res是为肿瘤靶标酵母Sir2p的哺乳动物直系同源物sirtuin-1(SIRT1)的激动剂。在对人胶质瘤组织样品和细胞系中SIRT1的表达水平的研究中发现，SIRT1在人脑胶质瘤组织样品中比在相邻组织中高表达，SIRT1沉默可抑制GBM细胞生存能力和侵袭，抑制GBM细胞系U251中AMPK、SIRT1的表达可增加其凋亡发生。然而我们的研究发现，SIRH的小分子激动剂Res可明显抑制人胶质母细胞瘤细胞U251的生长，并诱导其发生凋亡。结合一些研究发现SIRH激活可诱导GBM细胞自噬，我们推测，多信号通路的关键分子SIRT1在不同GBM细胞中被Res激活可能发挥的生物学功能不同。我们的前期工作中同时也发现，不同的胶质母细胞瘤细胞系对Res的反应不尽相同，有些敏感，如人胶质母细胞瘤U251和大鼠胶质母细胞瘤RG2细胞系；而LN229等细胞则表现为不敏感甚至耐受，但SIRT1在LN229这个GBM细胞系中的影响未见报道。
SIRT1在细胞内的生物活性和多条细胞信号通路有关。细胞自噬作为维护细胞内稳态的机制之一，在不同类型肿瘤中对肿瘤细胞的命运影响不同，在GBM细胞中，有报道激活SIRH阻碍自噬和肿瘤细胞生长，另有研究认为SIRH激活可诱导GBM细胞自噬但自噬对细胞的生理调节并不影响激活剂对肿瘤细胞的抑制作用。然而，SIRT1的小分子激活剂Res是否可以通过激活SIRT1在GBM中发挥抗肿瘤效应的研究鲜见报道，并且不同GBM细胞系对Res敏感性的差异是否与SIRT1激活或与其诱导的细胞自噬发挥的细胞保护或者细胞毒性作用有关也未明确，对此科学问题的进一步探究，可有助于揭示Res作用于不同GBM细胞的药物靶点对抗肿瘤活性的影响，探讨敏感性差异的自噬相关机制，可阐明Res治疗GBM的药用价值，为临床对GBM分子类型分析及在此基础上的精准治疗提供实验依据和理论参考。同时针对临床GBM的分子诊断基础上进行精准治疗和联合用药提供基础资料，并对改善患者预后具有重要的意义。
为此，本研究以对Res敏感性不同的人胶质母细胞瘤细胞系U251和LN229为研究对象，分析Res对GBM自噬的影响以及在对Res敏感性不同的细胞系中的自噬活性差异，从SIRH相关的自噬信号通路的活化状态的角度，进一步分析导致Res敏感性差异的可能原因，探讨Res在不同GBM细胞中抗肿瘤活性不同的分子机制，以期为Res在胶质母细胞瘤临床治疗中的应用提供新的科学依据，并且为提高耐药肿瘤的治疗效果提供新的思路和理论补充。
具体研究内容包括：
(1 )比较Res对不同GBM细胞自噬的影响，探讨不同胶质母细胞瘤Res的敏感程度与细胞自噬活性的相关性。
(2 )建立Res处理后自噬流定点动态检测实验体系，分析Res在不同持续作用时间中对不同人胶质母细胞瘤细胞系自噬激活及自噬流的影响，进一步探究Res的抗肿瘤生物活性与不同人胶质母细胞瘤细胞中自噬活性的关系。
(3 )分析调控自噬相关信号通路中的关键因子在Res处理后持续作用的不同时间点的表达和动态变化情况，探讨Res诱导不同人胶质母细胞瘤细胞自噬在其抗肿瘤活性差异中的功能角色及其机制。
(4 )建立腰椎穿刺给药Res治疗大鼠原位颅内胶质母细胞瘤移植瘤模型，在证实该用药途径的有效性基础上，探讨自噬在Res体内抗胶质瘤中的作用。
材料与方法选取对Res敏感性表现有显著差异的人胶质母细胞瘤细胞系LN229、U251，将其培养于含有10°%胎牛血清的DMEM培养基的高通量细胞爬片培养皿中，使用100yMRes处理LN229和U25148小时，其间，在加药前(0min组)、加药后48h内不同时间点分别收集细胞爬片和细胞，通过免疫细胞化学染色、透射电子显微镜对自噬体的观察、免疫荧光等方法对Res诱导的细胞自噬进行检测，分析敏感性差异的两种人胶质母细胞瘤细胞系中Res诱导的细胞自噬活化状态和特点以及差异性；采用免疫细胞化学、免疫蛋白印迹(Western-blotting， TO)等方法，从分子水平检测两种人胶质母细胞瘤细胞系经Res处理前后以及不同的时间点细胞自噬相关因子的表达及自噬状态和变化规律，借助激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察细胞内与自噬相关的微观结构特点，探讨Res诱导的细胞自噬在胶质母细胞瘤敏感性差异中的功能角色。根据自噬关键基因动态变化的特点选择自噬通路的关键因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、NAD+-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1(SIRT1)进行免疫荧光核移位分析和随时间变化蛋白表达的变化，探讨Res诱导的不同人胶质母细胞瘤自噬动态变化及其对两者之间敏感性差异的影响的可能机制。
结果
1.Res有效抑制人胶质母细胞瘤U251生长，诱导细胞凋亡，但LN229则对其耐受。TUNEL实验结果显示Res处理后LN229不发生凋亡，而U251在24?48h出现凋亡。
2.Res可诱导人胶质母细胞瘤LN229和U251发生细胞自噬。ICC、Western-blotting、细胞免疫荧光结果均显示Res处理后，有自噬相关蛋白Beclin1及LC3的表达。
3.Res处理的U251较LN229细胞有更高的自噬活性。ICC、Western-blotting、细胞免疫荧光结果均显示，U251细胞中的Beclin1、LC3、p62表达更强。
4.自噬活性动态观察发现，Res诱发的U251自噬持续时间更长，Res处理后24h内各时间点均有Beclin1、LC3的表达，说明Res处理后24h内，U251细胞中的自噬处于激活状态。
5.Res诱导的自噬具有波动性特征，即在Res处理开始至1h，自噬体的形成呈增多趋势，随即从1h至8h前，自噬体减少，自噬活性减弱，但在8h、10h及12h，自噬活性再一次升高，自噬体的形成大量增多，从12h之后，到24h、48小时，自噬活性逐渐减弱。
6.Res在敏感性不同的两个细胞系LN229与U251中诱导发生的自噬流不同。Res在不敏感细胞系LN229细胞中早期(1h以内)诱导的自噬激活，随着处理时间的延续，自噬流不能顺畅进行，在1h后的时间点中未见LC3被激活，LC3-II的加工不能完成，只能在细胞质中形成大量的隔离膜样的多层膜结构，不能形成自噬体。在U251细胞中，Res在早期诱导自噬发生，自噬被激活之后随着处理时间的延长呈波状变化，在细胞中形成并累积大量的自噬体，随着自噬过度激活，自噬体累积增多，降解减少，于12?24h达到高峰。
7.Res通过调控自噬通路GAPDH/SIRT1调控胶质母细胞瘤细胞自噬的发生，从而引起细胞死亡或是生存的结局不同，诱导U251自噬性死亡。Res促进U251细胞质中GAPDH入核，激活核内SIRT1的表达，从而脱乙酰化核内LC3，促进核内LC3出核形成LC3-II。过度激活的自噬导致自噬流不通畅，自噬体大量累积于细胞内，致U251细胞自噬性死亡。Res处理后，LN229细胞中GAPDH主要表达于细胞质，核内SIRT1无活化，不能促进核内LC3出核形成LC3-II。
8.TUNEL实验结果显示，Res处理后LN229无凋亡发生；而U251在24?48h开始凋亡，发生凋亡的时间出现在24h，是发生在U251细胞内自噬过度被激活之后。Western-blotting、激光共聚焦显微镜观察(confocal)结果、透射电镜结果表现为12h?24h，U251自噬被过度激活，自噬体降解减少，大量累积于细胞内，细胞质内出现大量的空泡状结构。
9.Res处理后，LN229和U251细胞中均表达Beclin1，LN229细胞在1h内有LC3的表达和活化，1h后活化下降，并且LC3-II的加工不能进行，同时，代表自噬体降解的p62在LN229被Res处理前后表达非常弱。实验结果表明，Res处理LN229之后诱导自噬的发生，但是自噬流不通畅，LC3表达降低，并且LC3I不能有效被加工为LC3II，从而自噬体不能形成、成熟。Res处理后U251细胞中的自噬相关基因表达随着处理持续时间不同，有规律性的变化。处理后，beclin1表达增强，LC3的表达增强出现在处理后1h及处理后10h;LC3-II/LC3-I比值的增加出现在处理后40min、12h、24h；同时p62的表达在1h、10h、24h增强，3h、8h表达降低，表明Res处理后诱导U251细胞发生两次自噬活性的增强，分别于早期40min?1h，稍晚期10h?12h，早期发生的自噬流顺畅，p62降解，第二阶段自噬的过度激活导致自噬体累积增多，p62降解减弱。
10.体内实验中，Res通过激活GAPDH/SIRT1信号通路调控颅内原位脑胶质瘤细胞移植瘤的自噬活性。免疫组织荧光结果和Western-blotting结果显示，Res腰椎穿刺给药治疗大鼠之后，颅内胶质瘤内自噬相关基因Beclin1、LC3，LC3-II/LC3-I升高，免疫组织化学结构提示，GAPDH、SIRT1在细胞核内的表达增强。
结论：
1.Res有效抑制人胶质母细胞瘤U251生长并诱导其发生细胞凋亡，但LN229则对其耐受。
2Res可诱导胶质母细胞瘤U251和LN229发生不依赖Beclin1的非典型性细胞自噬，U251细胞内的自噬活性高于LN229。
3.Res诱导人胶质母细胞瘤U251和LN229自噬流的受阻表现不同，在LN229中，自噬流的受阻发生在细胞核内LC3不能活化有效被加工为LC3-II，从而影响自噬体的形成和成熟，自噬启动之后的自噬体形成和成熟不能完成。在U251细胞中，Res处理后较短时间内诱导其发生的自噬流通畅，而自噬流受阻发生在10h之后，表现为自噬体大量累积，降解减少。
4.Res对U251的抗肿瘤活性与之诱导的U251细胞发生的过度自噬有关。
5.Res通过自噬通路GAPDH/SIRT1调控胶质母细胞瘤细胞自噬的发生，从而引起细胞死亡或是生存的结局不同。Res可在对U251作用早期促进GAPDH向核内移动，激活SIRT1，从而脱乙酰化核内LC3，过度激活自噬，导致大量自噬体在细胞内的积聚，在晚期引发自噬性程序型细胞死亡和细胞凋亡发生。
6.LN229对Res的药物抵抗性主要表现在Res不能促使LN229细胞质中的GAPDH向核内移动，从而不能调控核内自噬关键蛋白LC3成熟并出核与隔离膜结构结合形成自噬体，这或许是LN229对Res抗性的可能原因之一。
7.体内实验中，Res通过激活GAPDH/SIRT1信号通路增强颅内原位脑胶质瘤细胞移植瘤的自噬活性，表现抗肿瘤活性。
综上，本研究结论：Res激活U251细胞中GAPDH并促进其入核激活核内SIRT1表达从而去乙酰化核内自噬相关蛋白使LC3-II成熟并出核参与自噬体形成，自噬的过度激活导致自噬体大量堆积在细胞内从而导致U251发生自噬性死亡和凋亡，而Res引发的过度自噬在LN229细胞中并未发生从而导致LN229对Res处理不敏感，这可能与Res不能激活LN229细胞中的GAPDH有关。
Res可以诱导GBM细胞LN229和U251发生不依赖Beclin1的非经典自噬，并通过激活GAPDH/SIRT1自噬通路调控不同GBM细胞系对Res的敏感性差异。