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脊髓缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤是引起胸主动脉及脊柱手术后发生截瘫的最主要原因。由于治疗困难,致残率与致死率非常高。目前关于脊髓I/R损伤病理学的确切机制仍不清楚,有研究表明同一系列复杂的病理过程有关,包括:兴奋性中毒,氧自由基的生成,炎症和凋亡。因此,脊髓I/R损伤已经成为现代医学和神经科学领域的难题和热点。尽管目前使用很多策略来增加脊髓对缺血的耐受性,减少其神经并发症,但是临床尚无治疗截瘫病人的特效药物,迫切需要找到一种有效的药物治疗方式。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)作为第一信使参与信息传递,调节组织细胞的生化代谢与生理活动。更重要的是,组织损伤时有大量ATP释放,参与免疫和炎症反应。传导ATP信号的受体分为P2X和P2Y受体两类,其中P2X受体是配体门控的离子通道。P2X7受体是P2X受体第七个亚型,其独特的结构和功能特点倍受关注。高浓度ATP反复持续的激活可以使P2X7受体形成一个大的质膜孔道,导致细胞死亡。有研究表明,拮抗P2X7受体可以减轻大脑中动脉闭塞引起的脑缺血再灌注损伤。P2X7受体在大鼠脊髓I/R损伤中的作用目前尚未见相关报道。目的1、建立稳定的大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型2、研究P2X7受体脊髓缺血再灌注损伤后在脊髓灰质的表达变化。3、研究拮抗P2X7受体后,是否可以减轻脊髓缺血再灌注损伤,并探讨相关机制。方法1、运用2F-Fogarty导管阻断大鼠降主动脉下段,结合全身低血压,来建立稳定的大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。假手术组,其他同手术组,但不诱导脊髓缺血。2、脊髓缺血再灌注损伤后1d、3d、5d、7d,应用BBB评分评价大鼠运功功能的改变;取脊髓L4-L6行Nissl染色评价脊髓前角正常运动神经元的数量;运用双重标记的免疫荧光组织化学鉴定P2X7受体的表达;运用Western-blot检测术后不同时间点P2X7受体在蛋白水平上的变化。3、在大鼠缺血再灌注15min后,股静脉给予P2X7受体拮抗剂BBG(50mg/kg),术后第2d和3d连续给药,共给药3次;Saline组给予和BBG50组相同的剂量的生理盐水。观察术后4d、14d、21d,大鼠的运动功能的改善情况,然后行Nissl染色,双重标记的免疫荧光组织化学,检测mRNA和蛋白水平上P2X7受体的变化。并初步探讨P2X7的激活是否和炎症信号途径MAPK有关。结果1、建立了大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,实验中得出的模型成功复制的要点:雌性SD大鼠260-300g,肛温维持在35.9左右,术中大鼠的全身循环血压维持在46mmHg左右,股动脉血压维持在7mmHg左右,缺血9min。2、脊髓缺血再灌注损伤后1d,3d,5d,7d后大鼠的运动功能明显障碍,同sham组比较,BBB评分有显著的统计学意义(P<0.001),但是实验组间大鼠运动功能评分无显著的统计学意义(P>0.05)。随着再灌注损伤时间的延长,大鼠的脊髓前角的正常运动神经元数量明显减少,和sham组比,有显著的统计学意义(P<0.01),组间比较也有的统计学意义(P<0.05)。双重标记的免疫荧光组织化学结果显示:脊髓缺血再灌注损伤后,P2X7受体只在活化的小胶质细胞上表达,在神经元和星形胶质细胞上未见明显表达。活化的小胶质细胞存在于脊髓前角和背角的损伤部位。随着再灌注时间的延长,脊髓损伤程度加重,小胶质细胞的活化越多。同sham组比较,术后第3d,小胶质细胞开始出现大量明显的激活。脊髓缺血再灌注后,星形胶质细胞大量激活,1d有少量细胞发生形态学改变,但是不明显,到5d和7d时活化较为明显,并且星形胶质细胞只在损伤周围活化,损伤部位无星形胶质细胞。Western-blot结果显示:从再灌注损伤1d开始到7d,P2X7受体的蛋白水平逐渐增加,7d表达最多,同sham组和其他实验组相比(P<0.05)。3、给予拮抗剂BBG后,大鼠在术后4d,14,21d的运动功能明显改善,BBB评分同Saline组比有显著的统计学意义(P<0.01),其中第BBG50组第14d运动功能改善最为明显,同BBG504d比较有显著的统计学差异(P<0.01)。Nissl染色提示:给予拮抗剂BBG后脊髓前角正常运动神经元的数量明显增多,同Saline组比较,具有显著的统计学意义(P<0.01),其中14d的神经元变化最明显,同4d比较有显著的统计学差异(P<0.01)。RT-PCR结果显示:同sham组相比,Saline组P2X7受体的mRNA显著增多,有显著的统计学差异(P<0.01),其中14d表达最多,同Saline组4d比较有显著的统计学差异。Saline组相比:BBG组大鼠P2X7受体的mRNA表达明显下调,有显著的统计学差异(P<0.01),其中14d的下调较明显,同BBG组4d比较有明显的统计学意义(P<0.01)。Western-blot结果显示:给予拮抗剂BBG后,同Saline组比较,实验组P2X7受体的表达下调(P<0.01),其中以14d最为明显,同其他4d比较,(P<0.01);同Saline组比较:BBG组p-ERK1/2受体表达明显下调(P<0.01),其中以14d最为明显,同4d比较(P<0.01)。双重标记的免疫荧光组织化学显示:BBG组大鼠,14d小胶质细胞在脊髓前角和背角的活化程度明显减弱,活化范围明显减少,Iba1的荧光IOD与Saline组相比,有统计学差异(P<0.05)。BBG50组大鼠,14d星形质细胞在脊髓前角的荧光强度明显减弱, IOD与Saline组相比,有统计学差异(P<0.05)。Western-blot结果显示:给予拮抗剂BBG后,同Saline组比较,实验组P2X7受体的表达下调(P<0.05),其中以14d最为明显,同其他实验组比较,(P<0.05);实验组p-ERK1/2受体表达明显下调(P<0.01),其中以14d最为明显,同其他实验组比较,(P<0.01)。结论1、脊髓缺血再灌注引起的继发性损伤和P2X7受体的高表达有关,并且P2X7受体只在小胶质细胞上表达。2、拮抗P2X7受体的表达,可以通过通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的的激活,改善大鼠的运动功能,这种保护作用可能和减少ERK的磷酸化有关。3、P2X7受体可以作为治疗脊髓缺血再灌注损伤的新靶点。