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目的:皮肤损伤愈合是一个典型的炎症修复过程。可人为地分成三个阶段:炎症阶段、增殖阶段、再塑阶段。这些阶段在一定程度上相互重叠,没有明确的时间界限。炎症细胞的募集、成纤维细胞的激活、血管发生及肉芽组织的形成构成一系列错综复杂且相互交流的事件。最近研究显示,血液中的纤维细胞(circulatingfibrocytes,CFCs)也可以浸润到伤口局部,通过分化为肌成纤维细胞(myofibroblasts,Myfbs),参与到皮肤损伤愈合的进程。
CFCs是骨髓来源的间充质前体细胞,共表达造血干细胞抗原和成纤维细胞产物,诸如CD45和前胶原Ⅰ(procollagenⅠ),被定义为一类具有成纤维细胞特性的特殊白细胞亚群。在皮肤损伤愈合期间,CFCs占浸润细胞的10％左右。CFCs已经被推测在损伤愈合和组织修复进程中发挥至关重要的作用。除了分化为Myfbs外,CFCs还可以通过其他可能的机制参与到损伤愈合,诸如:抗原呈递;产生重要的细胞因子、趋化因子和生长因子;分泌细胞外基质(extracellularmatrix,ECM);促进血管发生。
胆碱系统由烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChR)和毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptors,mAChR),乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)及合成、降解Ach的酶组成。该系统对于神经信号的传递起到重要的调节作用。然而,研究表明,胆碱系统也被表达于不同种类的非神经元性组织或细胞。诸如:角质形成细胞、内皮细胞及外周的白细胞可以自身合成Ach,并表达不同的nAChR和mAChR。这已经被提出,Ach不仅是一种特异的神经递质,也是一种普遍的细胞递质。最近的研究显示了烟碱型乙酰胆碱受体alpha7亚单位(nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit,nAChRα7)可以被不同类型的非神经元细胞表达,在调节炎症、血管发生及角质形成细胞生物学方面发挥至关重要的作用,并密切牵涉到成纤维细胞中胶原的表达。
然而,nAChRα7在皮肤损伤愈合进程中表达和分布的特征,目前尚不清楚。本研究旨在探讨:(1)nAChRβ7在皮肤损伤愈合过程中表达和分布的特征;(2)浸润的CFCs和其分化成的Myfbs在皮肤损伤愈合中的分布特征;(3)nAChRα7是否表达于浸润的中性粒细胞、巨噬细胞、CFCs和其转化成的Myfbs。
材料与方法:
1、切创动物模型的建立健康成年雄性BALB/c小鼠45只,体质量30～35g,随机分为9组。其中皮肤切创分为8个时间段组,另一组为正常对照组,每组均为5只小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠,背部剪毛处理后,常规手术消毒,在背部中央做一纵行长1cm皮肤全层切口,深达筋膜。伤后每只单独饲养,避免细菌感染。分别于伤后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d将小鼠脱颈椎处死,取伤口处1.5cm×2.0cm皮肤组织,正常对照组小鼠麻醉后背部剪毛,不做切创,观察至14d,脱颈椎处死,取相同部位同等大小皮肤。各组5只小鼠的皮肤样本被均分为两部分,一部分用于石蜡切片的HE染色、免疫组织化学染色,另一部分用于Western blot和RT-PCR评价。
2、组织化学和免疫组织化学染色所取皮肤样本经4％多聚甲醛(pH7.4)固定12h,脱水、透明,包埋在石蜡中,制作5μm厚度连续切片,进行HE染色及nAChRa7的免疫组化染色。显微镜×400倍视野下,进行阳性细胞计数。
3、Western Blot检测nAChRα7蛋白提取样本总蛋白,上样量为50ug。转印到PVDF膜上后用5％脱脂奶粉封闭,用兔抗小鼠nAChRα7多克隆抗体(1:1000)、小鼠抗小鼠GAPDH单克隆抗体(1:2000)4℃孵育过夜,分别用相应的二抗37℃孵育,ECL发光1分钟,胶片中的蛋白条带经Biolmaging systems采集后进行灰度值测定。目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值作为相对表达量。
4、反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测nAChRα7的mRNA用Trizol Reagent提取皮肤样本的总RNA.用RNA PCR试剂盒扩增目的片段。PER产物电泳后,用嗅化乙淀染色,BioImaging Systems系统成像,用NIH image软件分析产物条带灰度,目的条带与GAPDH条带灰度值的比值作为相对表达量。
5、免疫荧光染色石蜡切片常规脱蜡至水,进行CD45/procollagenⅠ、CD45/α-SMA、F4/80/nAChRα7、CD45/procollagenⅠ/nnAChRα7、CD45/α-SMA/nAChRα7之间的双重或三重免疫荧光的共定位。
6、统计学分析用SPSS13.0 for Windows进行数据分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果:
1、切创后形态学改变伤后6h见多核粒细胞(polymorphonuclear cells,PMNs)出现在伤口的周围,于伤后12h显著增多。伤后1d圆形的单核细胞(mononuclear cells,MNCs)聚集于伤口的边缘,于伤后3d达到峰值。伤后3d,成纤维细胞(fibroblastic cells,FBCs)也开始出现在伤口底部,于伤后5d显著增多,伤后7d达到峰值。伤后5～10d,肉芽组织形成,其内可见大量的新生血管和FBCs。伤后10d,表皮完全覆盖创口。伤后14d,损伤区新生血管和FBCs数量显著减少,间质增多,肉芽组织向瘢痕组织转变。
2、免疫组织化学染色正常对照组小鼠皮肤nAChRα7分布于表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及少量成纤维样细胞。小鼠皮肤切创伤后6h～12h,可见少数PMNs和MNCs表达nAChRα7。伤后1d～3d,以MNCs表达为主。伤后5d～14d,nAChRα7主要表达于FBCs。此外,伤后5d～14d,再生血管的内皮样细胞和新生的表皮也显示了nAChRα7的阳性反应。nAChRα7阳性细胞率在伤后6h～12h较低,随着伤后时间的延长,nAChRα7阳性细胞率逐渐增加,于伤后7d达到高峰,随后逐渐下降。
3、Western blot和RT-PCR检测nAChRα7蛋白和mRNA被观察于小鼠正常皮肤和各切创组。皮肤切创后各时间段nAChRα7蛋白和mRNA变化规律基本一致。和正常组比较,伤后1d,蛋白和mRNA水平明显增强;伤后7d,达到高峰;10d～14d逐渐下降。
4、双重免疫荧光检测CFCs及其分化成的Myfbs小鼠皮肤切创后3d,CFCs(CD45+/procollagen I+ cells)开始出现于创口周围;伤后5d,CD45阳性的Myths(CD45+/α-SMA+ cells)开始出现于新生的肉芽组织。CFCs和CD45阳性的Myfbs的数量于伤后7d达到峰值。
5、双重/三重免疫荧光鉴定表达nAChRα7的细胞型在小鼠皮肤切创愈合的过程中,nAChRα7时序性表达于中性粒细胞、巨噬细胞、CFCs及其分化成的Myfbs。
结论:
1、正常小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及少量成纤维样细胞表达nAChRα7。
2、小鼠皮肤切创愈合过程中,CFCs浸润和分化的规律可为皮肤损伤时间的推断提供新的参考依据。
3、小鼠皮肤切创愈合过程中,nAChRα7时序性表达在PMNs、巨噬细胞、CFCs、Myfbs、再生血管的内皮样细胞和新生的表皮,提示nAChRα7可能参与皮肤损伤愈合。
4、小鼠皮肤切创愈合过程中,nAChRα7表达的规律性变化可用于皮肤损伤时间的推断。