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目的：支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的变态反应性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，它是由多种炎症细胞及炎性介质参与的气道慢性炎症性疾病。其特征是特应性个体异常增高的Th2型反应，Th2型反应表现为增多的Th2细胞及其分泌的细胞因子，如白细胞介素4（IL—4）、IL—5、IL—9、IL—13等，它们在哮喘的发生和发展中起重要的作用。哮喘的发生与过敏原暴露密切相关，其中屋尘螨变应原是诱发哮喘及其它变态反应性疾病最重要的变应原之一。据估计，全球约10%的人口对尘螨过敏，约80%的外源性哮喘由尘螨引起。屋尘螨过敏原含有多种过敏原成分，其中以Ⅰ型、Ⅱ型过敏原（Der p1、Der p2）所占比例最大，且对Der p1、Derp2过敏的患者亦最多，故Der p1与Der p2是非常重要的过敏原。研究已证实，哮喘与过敏性鼻炎患者血清中屋尘螨Der p2抗原特异性IgE抗体阳性率为70～90%，许多儿童在较早年龄即接触屋尘螨抗原，大约30%形成Th2型反应，表现为对屋尘螨抗原特异性IgE升高和皮肤试验阳性。应用尘螨变应原各种制品免疫治疗是此类疾病唯一的病因疗法。然而，目前采用的提取屋尘螨蛋白疫苗进行临床防治还存在很多问题，从而限制了变应原浸液在临床上广泛使用。据文献报道变应原免疫治疗全身不良反应事件的发生通常在5～35%，部分文献报导38%患者在免疫治疗过程中至少有一次全身不良反应事件：由于提取蛋白疫苗诱导高水平IgE抗体，导致部分接受提取蛋白疫苗免疫治疗患者症状发作或加重，而不得不停止免疫治疗。因此，研究高质量、安全的变应原疫苗是当前国内外该研究领域的热点问题。在变态反应学研究中，重组变应原由于成分单一，容易标准化，同时重组变应原具有与天然变应原相同的免疫原性，非常适用于变态反应疾病的诊断。也可以通过基因工程技术减少重组变应原IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，能增加治疗的疗效。我们通过基因合成的方法删除屋尘螨Der p2变应原的的IgE抗原表位，并通过基因工程获得重组Der p2突变体，旨在阐明重组Der p2突变体的免疫原性，为特异性免疫治疗与变应原疫苗研制提供理论基础。
方法：通过基因合成的方法删除屋尘螨Der p2变应原的部分氨基酸残基的基因序列，将编码基因定向克隆到pET32a原核表达质粒中，在大肠杆菌中（BL21）诱导表达Der p2重组蛋白。使用E.Z.N.A．·质粒小量提取试剂盒，按照说明书进行重组Der P2/pET32a质粒提取，经NdeⅠ/Eco RⅠ双酶切鉴定Der P2/pET32a重组质粒后，将Der P2/pET32a重组质粒转化到BL21表达菌。挑选几个菌落分别置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养2小时，加入IPTG诱导，继续振荡5小时。经12% SDS—PAGA鉴定有Der P2突变体表达的菌落大量扩增诱导。收集菌体，超声破碎菌体。根据多聚组氨酸尾重组蛋白的特性，采用BIO—RAD蛋白层析系统，取上清，在变性条件下用镍亲合柱层析法分离纯化重组蛋白。将层析收集到的主峰收集液进行复性。将18只Balb/c小鼠随机分为重组Der p2、Der p2突变体组、对照组。分别用重组蛋白及突变体免疫小鼠，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中IgE、IgG1与IgG2a抗体变化，用免疫斑点试验测定Der p2突变体的IgE结合能力。实验数据结果用SPSS10.0软件作统计学处理，进行单因素方差分析（ANOVA），用SNK（SNK法两两比较）作组间方差分析，P<0.05为差异有显著性。
结果：1、用NdeⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定Der P2/pET32a重组质粒，可切下大小在393bp左右的DNA片段，大小与预期结果一致，表明Der P2/pET32a重组质粒有目的基因。成功构建了Der p2突变体原核表达质粒，表达与纯化重组Der p2突变体；2、Balb/c小鼠腹腔免疫后0天，Der p2突变体组与重组Der p2组诱导IgG1、IgG2a与IgE抗体无明显差异（P>0.05）；腹腔免疫后7天，Der p2重组突变体组诱导IgG1抗体的产生与重组Der p2组无差异（P>0.05），但Der p2重组突变体组诱导IgE抗体的产生低于重组Der p2组（P<0.01），Der p2突变体组IgG2a抗体高于重组Der p2组（P<0.05）；腹腔免疫后14天，Der p2突变体组IgE抗体的产生低于重组Der p2组（P<0.01），Der p2突变体组IgG1低于重组Der p2组（P<0.01）。3、用屋尘螨过敏患者的阳性血清通过免疫斑点试验测定屋尘螨Der p2突变体及其屋尘螨重组Der p2变应原的IgE结合能力，以正常人血清为对照。结果表明：屋尘螨提取液与重组Derp2变应原同屋尘螨过敏患者的阳性血清具有较好的结合能力，重组Der p2突变体与屋尘螨过敏患者的阳性血清结合能力明显较低。
结论：1、成功构建屋尘螨Derp2变应原突变体的原核表达质粒，经双酶切及测序检测结果可靠。2、Derp2重组突变体能诱导小鼠产生IgG1抗体和IgG2a抗体，同时能明显减少IgE抗体的产生。3、屋尘螨提取液与重组Derp2变应原同屋尘螨过敏患者的阳性血清具有较好的IgE结合能力，重组Der p2突变体与屋尘螨过敏患者的阳性血清结合IgE能力明显较低。