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磷脂酶D(phospholipase D, PLD)可以水解磷脂产生磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和一个自由的头部基团,比如胆碱,乙醇胺和丝氨酸。模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因组中有12个PLD基因,研究发现在植物细胞中PLD参与许多信号转导过程,比如ABA,冷害,伤害,脱水,病原菌侵染和盐胁迫等。PA被认为是一个重要的信号分子,在许多胁迫应答期间,它的含量能够迅速升高,快速的传递信号。PA主要通过与下游的靶蛋白相互作用来调节植物的生长,发育。MAPK (mitogen-activated protein kinase)级联途径是被发现的在所有的真核生物细胞中最保守的信号调节模式,包括植物,微生物和动物。MAPK途径是MAPKKK-MAPKK-MAPK的级联作用模式,这种模式可以将受体与下游的靶蛋白连接起来,起到信号转递、放大的作用,它们在响应环境中的生物胁迫和非生物胁迫中起到了很重要的作用。本实验室以前的研究结果中发现,PA能够影响MPK6的活性。在此基础上,为了进一步阐明PA与MPK6之间的相互关系,我们用MPK6抗体从拟南芥蛋白抽提物中免疫共沉淀MPK6蛋白,然后加入PA(16：0-18：2)检测MPK6的活性,PA能够明显提高了MPK6的活性,当加入同样浓度的PC时对MPK6的活性没有影响。进一步比较了用NaCl处理后拟南芥WT和pldal突变体幼苗中的MPK6活性,用免疫复合物激酶分析方法分析了WT和pldal突变体中内源MPK6活性,发现NaCl处理导致WT中MPK6活性迅速提高,但是在pldal突变体中则没有明显的变化。用抗AtMPK6抗体检测蛋白的表达水平,发现蛋白表达量在盐处理下没有发生变化。这些数据表明在NaCl胁迫下,PLDal水解磷脂产生的PA能够与MPK6结合,进而增强MPK6激酶的活性,而且这种变化主要是由于蛋白激酶翻译后修饰作用引起的。将pldal突变体和mpk6突变体进行杂交,筛选到pldal/mpk6双突变的纯合体,从遗传学角度分析PA和MPK6之间的相互作用。分别将WT, pldal, mpk6和pldal/mpk6双突变体的种子种植在含有NaCl的1/2MS平板上,萌发6天后,发现pldal/mpk6双突变体的萌发率比pldal突变体和mpk6突变体更低。进一步分析各种突变体幼苗对盐敏感性的差异,将WT, pldal, mpk6和pldal/mpk6双突变体在MS上生长4天的幼苗转移到含NaCl的1/2MS平板上生长12天,发现pldal突变体,mpk6突变体和pldal/mpk6双突变体的主根生长受到抑制,而且抑制程度依次呈增强趋势。在NaCl的培养基中pldal/mpk6双突变体表现出更明显的白化现象。这些结果说明表明在植物中PLD,PA和MPK6能共同协调应答盐胁迫,调节植物的耐盐性。拟南芥中SOS1(salt overly sensitive1)是一个非常重要的质膜Na+/H+转运蛋白,用pull down实验发现在体外MPK6可以直接结合SOS1的胞内区域,将SOS1的胞内C端区域截取成6个片段,进一步pull down分析发现MPK6仍然能够与SOS1CT7(1044-1146氨基酸)结合。从植物蛋白抽提物中免疫共沉淀的MPK6可以磷酸化SOS1CT7蛋白片段。免疫共沉淀NaCl处理后的MPK6,这种磷酸化作用进一步增强,而且PA也能够增强MPK6对SOS1CT的磷酸化活性。另一方面,克隆了拟南芥基因组中5个MKKs, MKK1、MKK2、MKK5、MKK6和MKK9,将其连接到带GST标签的载体中,在大肠杆茵中表达后纯化。通过体外蛋白-脂结合实验,发现只有MKK9可以强烈的结合PA,而且不结合其他的磷脂。研究证实大肠杆菌中表达和纯化的MKK9能磷酸化MPK6,施加外源PA(16：0-18：2),能增强MKK9对MPK6-HIS的磷酸化作用。在拟南芥原生质体表达有持续性激酶活性的MKK9(EE)-Flag蛋白或者同时表达MKK9(EE)-Flag和MPK6-HA蛋白,用PA处理原生质体后增强了MKK9对MPK6的磷酸化作用和MPK6对MBP(髓鞘碱性蛋白)磷酸化活性。此外,NaCl处理原生质体反而会抑制MKK9(EE)-Flag对无活性的MPK6(Km)-GST的磷酸化作用,但是会增强共同表达MKK9(EE)-Flag和MPK6-HA时MPK6对MBP的磷酸化活性。这些结果表明PA能够同时结合MPK6和MKK9,增强MKK-9对MPK6的磷酸化活性。