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第一部分：卡介苗HSP70基因转染HL-60细胞瘤苗制备及抗瘤机制的研究目的构建卡介苗热休克蛋白70(BCG HSP70)的真核表达载体,通过基因转染表达于急性早幼粒白血病细胞标准细胞株(HL-60)细胞表面,制备细胞膜表面修饰的瘤苗并研究其抗瘤作用和机制。方法(1) BCG HSP70基因重组载体构建及序列测定：利用PCR方法从卡介菌基因组中扩增出带酶切位点的BCG HSP70基因,与真核质粒表达载体pDisplay连接,构建重组载体pDisplay-HSP70并进行DNA测序鉴定。(2)膜表面表达BCG HSP70的HL-60细胞瘤苗的制备：利用脂质体2000将重组载体pDisplay-HSP70转染HL-60细胞,免疫荧光单克隆抗体进行细胞表面修饰鉴定。(3)转染后的HL-60细胞抗原性检测：实验组分为3个亚组：1组：未进行转染的HL-60细胞组(HL60-wt);2组：转染空载体pDisplay的HL-60细胞组(HL60-pDisplay);3组：转染重组载体pDisplay-HSP70的HL-60细胞组(HL60-HSP70);收获各组HL-60细胞,丝裂霉素C灭活后与同种异体外周血T淋巴细胞按照1：10比例混合培养72h,CFSE标记和流式细胞术测定淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测细胞因子IFN-y水平；丝裂霉素C灭活后的HL-60细胞与T淋巴细胞按照1：10比例混合培养48h后,加入野生型HL-60细胞(效应细胞：靶细胞分别为10：1,20：1,40：1,80：1)共培育12h, LDH释放改良法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。结果(1)PCR扩增获得的BCG HSP70基因大小与GeneBank公布的结核杆菌HSP70基因一致。酶切电泳和DNA测序证实重组载体pDisplay-HSP70构建正确。(2)共聚焦显微镜观察检测证实BCG HSP70表达在转染后的HL-60细胞表面。(3)转染后的HL-60细胞免疫原性检测结果：①异体淋巴细胞增殖数：与实验HL60-wt组、HL60-pDisplay组比较,HL60-HSP70组能明显促进异体T细胞扩增(p<0.05)；而HL60-pDisplay组与HL60-wt组间比较无明显差异(p>0.05)。②细胞因子水平：HL60-wt组、HL60-pDisplay组、HL60-HSP70组IFN-y含量分别为(100.23±3.55)pg/ml,(102.68±3.23)pg/ml,(146.01±2.98)pg/ml。HL60-HSP70组明显高于HL60-wt组和HL60-pDisplay组(p<0.05), HL60-pDisplay组与HL60-wt组间比较无明显差异(p>0.05)。③免疫活性细胞杀伤活性：当效应细胞：靶细胞比例固定,HL60-HSP70组的杀伤率明显高于HL60-wt组和HL60-pDisplay组(p<0.05), HL60-pDisplay组与HL60-wt组间比较无明显差异(p>0.05)；当效应细胞：靶细胞比例为10：1至80：1,HL60-HSP70组组内CTL细胞杀伤活性逐渐增强。结论1.成功构建了BCG HSP70的真核表达载体pDisplay-HSP70。2.将BCG HSP70成功转染到HL-60细胞膜表面,制备了膜表面表达BCGHSP70的HL-60细胞瘤苗。3.膜表面表达BCG HSP70的HL-60细胞能促进异体淋巴细胞增殖,且分泌高水平的IFN-γ分子,以及提高细胞毒性T细胞的杀瘤活性,提示BCG HSP70基因转染后,能明显增强HL-60细胞的免疫原性。第二部分：卡介苗HSP70基因转染新鲜白血病细胞瘤苗制备及抗瘤机制的研究目的体外培养白血病细胞,并制备膜表面表达卡介苗热休克蛋白70(BCG HSP70)的瘤苗,以进一步研究其抗瘤作用和机制。方法(1)新鲜白血病细胞的体外培养及其鉴定：分离收集15例急性髓系白血病(AML)细胞,用含细胞因子(SC、FL、IL-3和IL-6)的无血清培养液Stemspan(?)体外培养,和15例B系急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞,含细胞因子(SCF、FL、 IL-3和IL-7)的无血清IMDM培养基体外培养,通过显微镜观察细胞生长形态、细胞化学染色和免疫表型测定验证所培养的白血病细胞。(2)膜表面表达BCG HSP70的白血病细胞瘤苗的制备：利用脂质体2000将重组载体pDisplay-HSP70转染到己被鉴定的白血病细胞,免疫荧光单克隆抗体进行细胞表面修饰鉴定。(3)转染后的白血病细胞免疫原性检测：实验组分为3个亚组：1组：未进行转染的白血病细胞组(wt-LC);2组：转染空载体pDisplay的白血病细胞组(pDisplay-LC);3组：转染重组载体pDisplay-HSP70的白血病细胞组(HSP70-LC);收获各组白血病细胞,丝裂霉素C灭活后与获得完全缓解的急性白血病患儿自体骨髓T淋巴细胞按1：10比例混合培养72h,CFSE标记和流式细胞术测定淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测细胞因子IFN-γ水平；丝裂霉素C灭活后的各组白血病细胞与T淋巴细胞按照1：10比例混合培养48h后,加入新鲜白血病细胞(效应细胞：靶细胞分别为10：1,20：1,40：1,80：1)共培育12h,LDH释放改良法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。结果(1)短期培养的白血病细胞呈集落样悬浮生长,并保持增殖特性；在培养的1-10天,细胞增殖较快,以后逐渐变慢。悬浮培养第10天收集细胞进行免疫表型测定,15例AML细胞的CD13、CD33表达,与培养前比较差异无统计学意义(p>0.05)；15例B-ALL细胞的CD19、CD10、CD22表达,与培养前比较差异无统计学意义(p>0.05)。(2)共聚焦显微镜观察检测证实BCG HSP70表达在转染后的白血病细胞表面。(3)转染后的白血病细胞免疫原性检测结果：①自体淋巴细胞增殖：实验wt-LC组、pDisplay-LC组、HSP70-LC组CFSE阳性率分别为(17.55±0.32)%,(17.78±0.30)%,(31.67±1.28)%。HSP70-LC组明显高于wt-LC组和pDisplay-LC组(p<0.05), pDisplay-LC组与wt-LC组间比较无明显差异(p>0.05)。②细胞因子水平：HSP70-LC组IFN-y含量为(140.30±4.46) pg/ml,明显高于wt-LC组((88.61±3.42)pg/ml)和pDisplay-LC组((88.96±3.43)pg/ml)(p<0.05);pDisplay-LC组与wt-LC组间比较无明显差异(p>0.05)。③免疫活性细胞杀伤活性：固定效应细胞：靶细胞比例,与实验、vt-LC组、pDisplay-LC组比较,HSP70-LC组能明显提高CTL细胞的杀伤活性,pDisplay-LC组与wt-LC组间比较无明显差异(p>0.05)；当效应细胞：靶细胞比例为10：1至80：1,HSP70-LC组组内CTL细胞杀伤活性逐渐增强。结论1.体外成功培养新鲜急性白血病细胞,短期培养可以明显增加白血病细胞数量,而对白血病细胞表面抗原表达影响不大,能够维持其生物学特性。2.将BCG HSP70成功转染到白血病细胞膜表面,制备了膜表面表达BCG HSP70的白血病细胞瘤苗。3.膜表面表达BCG HSP70的白血病细胞能促进自体淋巴细胞增殖,且分泌高水平的IFN-y分子,以及提高细胞毒性T细胞的杀瘤活性,提示BCG HSP70基因转染后,能明显增强白血病细胞的免疫原性。第三部分：HSP70基因转染对小鼠淋巴细胞白血病细胞免疫原性的研究目的探讨卡介苗热休克蛋白70(BCG HSP70)基因转染对小鼠淋巴细胞白血病细胞(L1210)致瘤原性及免疫原性的影响。方法利用脂质体2000将BCG HSP70基因转入小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210表面,获得高表达HSP70分子的L1210-HSP70细胞,作为肿瘤疫苗进行下列研究：(1)裸鼠及同系小鼠致瘤性实验：将L1210-HSP70细胞、转染空载体pDisplay的L1210细胞(L1210-neo)及其亲本细胞分别接种BALB/c裸鼠及同系DBA/2小鼠,观察肿瘤生长情况,小鼠生存时间,IFN-y ELISPOT检测针对L1210细胞的IFN-y分泌Thl细胞,以及病理切片观察和CD8免疫组化检测。(2)制备荷L1210瘤DBA/2小鼠,对侧皮下分别接种PBS、L1210细胞、L1210-neo细胞及L1210-HSP70细胞,通过观察瘤体生长情况及小鼠生存时间,明确L1210-HSP70瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。(3)预先向DBA/2小鼠分别接种PBS、L1210细胞、L1210-neo细胞及L1210-HSP70细胞后,均用野生型L1210细胞攻击,通过观察瘤体生长情况及小鼠生存时间,明确L1210-HSP70瘤苗对L1210细胞攻击的免疫保护作用。结果共聚焦显微镜观察检测证实BCG HSP70表达在转染后的小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210表面。(1)裸鼠致瘤性：L1210-HSP70细胞具有与野生型细胞同样的致瘤性,成瘤率100%。(2)同系小鼠致瘤性：L1210-HSP70组肿瘤生长缓慢或不成瘤,DBA/2小鼠生存期明显延长或长期存活,而L1210组、L1210-neo组全部成瘤,小鼠生存时间无明显差异；采用IFN-γ ELISPOT检测试剂盒检测显示L1210组和L1210-neo组小鼠脾淋巴细胞中仅有很少量的特异性T细胞,而L1210-HSP70组针对L1210细胞的特异性T细胞数量明显增加,差异有显著性差异；L1210-HSP70组瘤体病理切片示点片状坏死区,呈彻底的凝固性坏死,且周边可见到淋巴样细胞,免疫组化检测示大量CD8+T淋巴细胞浸润。(3)瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用：L210-HSP70组肿瘤生长受到显著抑制,瘤体平均直径明显减小,荷瘤小鼠生存时间明显延长。而PBS组、L1210组和L1210-neo组肿瘤生长无差异,小鼠生存时间亦无明显差异。(4)抗肿瘤攻击的免疫保护作用：L210-HSP70组肿瘤出瘤时间明显延长,生长受到显著抑制,瘤体平均直径明显减小,荷瘤小鼠生存时间明显延长。结论1.BCG HSP70基因转染能有效增强肿瘤细胞的免疫原性,激活特异性T细胞,降低肿瘤细胞的致瘤性。2. BCG HSP70基因转染具有提高宿主抗瘤免疫作用。