【摘 要】
：
目的:构建表达猪类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）活性片段与补体C3b的酵母双杂交细胞株,检测CR1-like与C3b的识别结合,以期为课题组后期关于“猪红细胞CR1-like功能域分子结构的解析”提供理论数据。方法:本试验通过酵母双杂交技术对CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞Y2HGold内是否发生识别结合进行检测。技术方法如下:
【基金项目】
：
国家自然科学青年基金项目（31702221）； 山西省“1331工程”重点创新团队建设项目（20171115）； 山西省高等学校科技创新项目（2019L0364）；
论文部分内容阅读
目的:构建表达猪类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）活性片段与补体C3b的酵母双杂交细胞株,检测CR1-like与C3b的识别结合,以期为课题组后期关于“猪红细胞CR1-like功能域分子结构的解析”提供理论数据。方法:本试验通过酵母双杂交技术对CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞Y2HGold内是否发生识别结合进行检测。技术方法如下:1)运用基因重组技术将CR1-like（3-6）和CR1-like（8-11）基因与p GBKT7载体连接,构建酵母双杂交诱饵质粒p GBKT7-CR1-like（3-6）和p GBKT7-CR1-like（8-11）,将重组质粒与p GBKT7分别转化入酵母细胞Y2HGold中,通过观察酵母菌落在SD/-Trp缺省培养板的生长情况,检测诱饵质粒对酵母细胞的毒性和自激活作用。2)运用基因重组技术将C3b基因与载体p GADT7连接构建重组质粒p GADT7-C3b,通过观察酵母菌落在SD/-Leu缺省培养板的生长情况检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。3)运用酵母共转化的方法将p GBKT7-CR1-like与p GADT7-C3b重组质粒共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）筛选共转化成功的酵母菌,再利用报告因子的表达鉴别细菌在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况和菌落的颜色变化,初步观测CR1-like活性片段与补体C3b是否在酵母细胞中发生结合。4)运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b识别结合复合物,并对该复合物进行Western blot鉴定。结果:1)重组质粒p GBKT7-CR1-like（3-6）和p GBKT7-CR1-like（8-11）经Nco I、Bam H I双酶切鉴定后,电泳可见518 bp和738 bp的条带,与预期大小相同,说明重组质粒构建成功;分别转化了重组质粒p GBKT7-CR1-like（3-6）和p GBKT7-CR1-like（8-11）的酵母菌与转化p GBKT7空质粒的酵母菌在SD/-Trp培养基上的菌落大小及数量相近,表明重组质粒对酵母菌无毒性;并且分别转化了p GBKT7-CR1-like（3-6）和p GBKT7-CR1-like（8-11）的酵母菌在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal平板上正常生长,在SD/-Trp/X/Aba平板上不能生长,证明诱饵质粒无自激活性。2)p GADT7-C3b重组质粒经Eco R I和Xho I双酶切鉴定后,得到1941 bp的条带,符合预期大小,说明重组质粒构建成功;分别转化了p GADT7-C3b和p GADT7的酵母菌在SD/-Leu平板上的生长状态及数量基本相同,表明C3b蛋白对酵母菌的生长无毒性作用;包含p GADT7-C3b的酵母菌在SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal平板上正常生长,在SD/-Leu/X/Aba平板上不能生长,表明p GADT7-C3b无自激活性。3)p GBKT7-CR1-like与p GADT7-C3b基因共同转入Y2HGold酵母细胞后,酵母菌在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落变蓝,证明CR1-like（3-6）和CR1-like（8-11）与C3b在酵母菌内发生结合。4)Western blot检测,结果可见阳性免疫条带,表明酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合复合物。结论:1)成功构建了检测猪CR1-like活性片段与补体C3b识别结合的酵母双杂交体系。2)体外条件下,猪红细胞CR1-like活性片段能够与C3b识别结合,为后期课题组研究C3b介导猪红细胞CR1-like发挥免疫功能奠定基础。
其他文献
中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根,为常用大宗药材,广泛应用于临床配方,具有调节免疫功能、降压和抗心肌缺血等多种药理作用。皂苷为黄芪的主要药效成分,是黄芪诸多健康益处背后的主要生物活性化合物。目前包括皂苷在内的黄芪生物活性物质的代谢合成途径研究较少,因而筛选和鉴定次生代谢候选基因,将有助于解析黄芪主要药效成分生物合成的分子机理。本研究以蒙古黄芪Astragalus membranaceu
【目的】鼠伤寒沙门菌是一种可感染多种宿主的人兽共患病原微生物,具有重要的公共卫生研究意义。实验室前期蛋白质组学研究发现,在麝香草酚选择压力下,沙门菌中的一种功能未知因子YbiH蛋白表达水平明显降低,初步验证发现其与细菌致病性关系密切,但YbiH在沙门菌致病过程中发挥何种功能还不清楚,有必要了解清楚其在沙门菌生长过程中的生物学功能,从而为沙门菌污染的控制和沙门菌病的有效防治提供一定的理论依据。【方法
营养剥夺可使动物发生营养应激,导致新陈代谢改变甚至紊乱。骨骼肌是动物新陈代谢的主要部位之一,其在营养应激状态下代谢调节的分子机制尚不清楚。本研究旨在结合在体和离体试验,利用转录组测序（RNA-Seq）和生物信息学分析技术,鉴定和分析营养应激状态下骨骼肌中代谢相关的差异表达基因（DEGs）,为揭示骨骼肌应对营养应激的代谢调节机制和探讨动物营养应激的调控措施奠定基础。本试验将10只具有相似特征的成年健
目的:开展一项离散选择实验量化胃癌患者的术后随访需求与偏好,并确定关键属性及相应水平对胃癌患者接受术后随访策略的影响程度,来为优化胃癌患者的术后随访策略提供参考,进而提高患者的随访依从性,预防相应的并发症,减轻患者的心理负担,提高患者的生活质量。方法:本研究应用离散选择实验的研究方法,于2019年9月至2020年9月选取了我国东部、中部和西部地区共十二家医院调查胃癌患者的术后随访偏好。首先,基于文
目的:本试验旨在体外筛选出能够促进蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞增殖的中药单体化合物,并探讨中药单体化合物促进颗粒细胞增殖的可能机制。方法:试验选取200日龄的海兰褐蛋鸡,分离培养小黄卵泡颗粒细胞,使用间接免疫荧光法对颗粒细胞进行鉴定。噻唑蓝比色法（MTT）检测各中药单体化合物在颗粒细胞上的最大安全浓度;通过实时荧光定量PCR（q PCR）检测各中药单体化合物对颗粒细胞增殖细胞核抗原（Proliferati
目的:探讨蛇床子素（Osthole,Ost）对鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮（Progesterone,P4）分泌的影响。方法:分离培养200日龄海兰褐蛋鸡的等级卵泡颗粒细胞,采用HE染色及间接免疫荧光法进行鉴定;噻唑蓝比色法（MTT）测定Ost对颗粒细胞活力的影响。用不同浓度（5、2.5及1.25μg/m L）的Ost分别作用于颗粒细胞6、12、18及24 h后,ELISA检测颗粒细胞上清中P4含量。用
目的:为制备实验用犬补体受体单克隆抗体（Complement receptor type 1（CR1）-like Mc Ab,CR1-L Mc Ab）,本实验以犬为研究对象开展实验,以期为课题组后期“犬类补体受体分子功能研究”和“犬类补体受体杂聚抗体”等方面的研究提供理论数据和技术手段。方法:本实验以健康比格犬为研究动物进行实验。实验方法如下:1)运用普通PCR技术克隆犬CR1-L基因的c DNA
现代农业生产中氮肥的过量使用,导致大气氮沉降水平不断上升。氮输入的增加会影响土壤理化性质和植物的养分吸收,进而影响土壤氮素的利用和损失状况。氨挥发是陆地生态系统氮素损失的重要途径之一,但有关草地生态系统氨挥发的研究还很匮乏。本研究以北方农牧交错带典型半干旱草地生态系统（山西省右玉县）为研究对象,采用随机区组设计,设置了8个氮添加梯度(NH4NO3,0、1、2、4、8、16、24和32gNm-2y-
农作物土壤盐渍化日渐加剧,严重影响农作物生长、发育、产量和品质,制约着农业可持续发展。改良土壤盐渍化和提高植物对盐胁迫的抗性是解决盐渍化危害的重要措施。光自养微藻的藻际存在许多共栖细菌,其中有些藻际菌群能促进藻细胞生长或提高逆境胁迫抗性。来源于高盐水体的杜氏盐藻（Dunaliella salina）藻际是否共栖有促进藻细胞生长或提高耐盐性的菌群还未见报道。因此,本文以杜氏盐藻Ds-SXYC-2株系
气孔是植物同外界进行氧气、二氧化碳以及水交换的场所,与植物的光合作用,水分利用效率密切相关,乳突是植物叶表面疏水结构,也是抵抗病原菌入侵的重要屏障。关于气孔和乳突作用和发育的研究在拟南芥等物种中较多,谷子方面的相关研究报道较少。本研究从我国谷子核心种质中选取362份作为试验材料,于2018年4月至10月在山西大同、晋城、太谷三个地区种植,选取抽穗期植株倒三叶,对其上表皮气孔密度、大乳突密度、小乳突