我国奶牛养殖业中普遍存在抗生素滥用的问题,抗生素滥用往往会催生多重耐药细菌,对公共卫生安全造成威胁。其中,因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA）而导致的奶牛乳房炎,往往给奶牛健康和奶业生产造成严重威胁。治疗MRSA所导致的感染往往有以下两个难点:（1）MRSA可能带有多重耐药基因,对多种抗生素具有耐药性,限制了可治疗药物的选择;（2）金黄色葡萄球菌可粘附并侵入宿主细胞内,从而逃避了宿主击杀和抗生素的作用。为了解陕西地区多重耐药的葡萄球菌流行状况,为指导陕西地区奶牛的健康养殖提供理论依据和参考,本课题组在陕西本地三家不同规模的奶牛养殖场中,选取了53头疑似患有奶牛乳房炎的奶牛,共采集得到了200份牛奶样品,从这些样品中,分离得到了144株葡萄球菌（吴兆韡,2018）。在此基础上,对这144株葡萄球菌进行了4种畜牧生产中常用抗生素（头孢唑林、替考拉宁、环丙沙星和氯霉素）的耐药检测试验。试验结果发现:144株葡萄球菌中,7.6%的菌株对替考拉宁耐药,14.6%的菌株对头孢唑林耐药,50%的菌株对环丙沙星耐药,11.1%的菌株对氯霉素耐药。其中对两种、三种抗生素耐药的菌株分别占总数的12.5%、6.9%。且发现一株对这四种抗生素均耐药的表皮葡萄球菌。接下来,为了探究金黄色葡萄球菌中可能与耐药性有关的基因,本课题组分析了在苯唑西林刺激下BA01611菌株RNA-seq数据（待发表）。基于该RNA-seq数据分析,选择了其中12个表达水平发生显著变化的基因并成功构建其敲除载体。将这些载体转入奶牛乳房炎来源的BA01611菌株后,得到了7株BA01611基因敲除菌株,加上前期已构建的5个未知其确切功能的基因敲除菌株（本课题组乔丹丹构建,具体数据待发表）,最终发现了5个与金黄色葡萄球菌抗性和生物膜形成能力相关的基因。从上述试验所构建的,12株奶牛乳房炎来源的金黄色葡萄球菌BA01611的敲除菌中,发现了对多种抗生素抗性和细胞粘附均有影响的lcp C基因。Lcp C属于Lyt R-Cps A-psr家族蛋白,该家族蛋白参与将磷壁酸和胞外多糖连接至肽聚糖的过程。在4株菌中[2株MRSA,2株对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）]敲除lcp C后,MRSA菌株和MSSA菌株对β-内酰胺类、糖肽类抗生素的抗性都显著下降。同时对4种细胞系（A549,MCF7,HCMEC和Ha Ca T）的粘附水平也均有不同程度下降。通过电镜（扫描电镜、透射电镜）观测,我们发现敲除菌细胞壁结构变得粗糙、疏松,细菌表面塌陷。通过构建小鼠脓毒血症治疗模型,我们发现Lcp C的敲除可显著降低MRSA菌株的致病性:感染敲除菌的小鼠生存率提高（由野生组的30%提高至敲除组的70%）,肺部组织中炎症浸润程度降低,肺部和脾脏中的细菌载量下降,外周血液的炎症因子蛋白水平下降。MRSA感染巨噬细胞后,lcp C敲除组的细胞炎症因子水平相较于野生型也显著下降。通过q RT-PCR和双分子荧光互补试验,我们也尝试探寻了与Lcp C可能相互影响的蛋白:敲除lcp C后,与细胞壁合成有关的基因和细胞表面蛋白的m RNA水平显著降低;在HEK 293T细胞中,Lcp C蛋白可与Stk1、Stp1和Lyt S蛋白直接相互作用。综上所述,本课题试验一揭示陕西地区奶牛养殖场中,奶牛乳房炎来源的耐药葡萄球菌分布广泛,存在较多对两类、三类抗生素均耐药的葡萄球菌,甚至发现了一株对四种抗生素均耐药的葡萄球菌。这警示我们,在奶牛饲养管理的过程中,应合理使用抗生素,以防多重耐药的葡萄球菌甚至致病性细菌大规模流行。试验二通过构建金黄色葡萄球菌未知基因的敲除菌株,并分别对其相关表型进行初步研究,发现了5个金葡菌中与苯唑西林抗性有关的基因,1个与苯唑西林抗性和生物膜形成能力均有关的基因,为后续研究因金葡菌感染而造成的奶牛乳房炎构建了资源库。试验三首次证明了Lcp C的敲除可使金黄色葡萄球菌的细胞壁形态发生变化,进而影响金葡菌对抗生素的耐药性和对细胞的粘附作用,这为防治因金黄色葡萄球菌导致的奶牛乳房炎提供了重要的理论依据。