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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种全球性多发性疾病,其关节置换手术的比例逐年上升。RA传统假体虽然可以实现早期临时固定,但是无法形成良好的界面骨整合,从而影响假体的长期稳定性。因此,我们需要针对RA的发病机制和病理基础,研发具有生物活性界面的人工关节假体,对解决RA假体松动高发的难题具有重要的临床意义。研究表明RA术后假体松动主要与传统假体设计和周围炎症水平有关。传统钛合金内植物与宿主骨之间的弹性模量不匹配,易产生应力遮挡效应。目前电子束熔融(electron beam melting,EBM)技术制备的3D打印内植物具有适宜的弹性模量,可以减低应力遮挡及骨吸收。此外,金属微孔结构可以提供骨长入空间,从而提高内植物的骨整合能力和长期稳定性。然而金属支架的生物惰性及RA的炎症微环境不利于骨整合,因此我们需要在金属微孔表面构建新型的“生物活性界面”。作为生物活性物质的载体,壳聚糖水凝胶可以提高金属微孔界面的骨整合效率。水凝胶通过搭载外源性间充质干细胞(MSCs),不仅可以提高金属微孔界面的细胞粘附,而且利于发挥MSCs免疫调节作用、降低局部炎性水平,从而利于成骨分化潜能的发挥。在各类MSCs中,脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有较强的免疫调节能力。然而单独应用MSCs的免疫调节能力较低,局部联合应用英夫利昔有望发挥协同抗炎作用。因此,本研究试图构建一种“3D打印金属微孔/水凝胶/英夫利昔/ADSCs”的生物活性界面,其界面缓释的英夫利昔与ADSCs发挥协同免疫调节作用,构建利于成骨分化的微环境,促进金属微孔-骨界面的整合能力。本研究可为RA等成骨不良的关节置换患者人工假体界面设计提供实验支持。第一部分:脂肪源性干细胞(ADSCs)体外分离培养及其多向分化潜能和细胞表面标志的检测鉴定于家兔腹股沟皮下脂肪垫获取脂肪组织,并用酶消化法分离培养ADSCs。研究结果表明:培养至第3代时,ADSCs细胞形态较一致,呈纺锤形或多角形;ADSCs的增殖速度较快。流式细胞术检测表明CD44和Integrin-β呈强阳性,WT、CD34、CD31、c-kit和VCAM1呈弱阳性表达。成骨培养21天后,茜素红染色可见红色钙化结节形成;成脂培养16天后,油红O染色可见胞质内橙红色脂滴。实验结果表明所获得的细胞为ADSCs,并且具有良好的增殖和多向分化潜能。第二部分:3D打印金属微孔/水凝胶的生物活性界面的构建采用EBM系统制备3D打印钛合金微孔内植物。研究结果表明:micro-CT显示钛合金微孔完全连通,其孔隙率为67±4%,孔径为404±14μm,金属小梁直径为242±15μm。力学检测结果显示,其压缩强度为104±3 MPa,弹性模量为4.9±0.2 GPa。利用氧化透明质酸(HA-ALD),N-羧乙基壳聚糖(CEC)和己二酸二酰肼(ADH)的反应制备壳聚糖水凝胶。室温条件下,溶胶混合约20s可转变为水凝胶;溶胶混合后可通过26号注射器,未见堵塞现象。孵育1小时,水凝胶表现平衡的溶胀状态,最大溶胀比达到50%。水凝胶可保持初始形态,且未见明显重量降低。体外和体外降解实验:14天时水凝胶重量降低约为50%,30天时降解完全。用1mL注射器注射器将英夫利昔/ADSCs/A溶胶混合液从自上而下注入支架空隙,然后将B溶胶同样注入支架空隙,静置20 s进行液-固转变,完成3D打印金属微孔/水凝胶生物活性界面的构建。SEM显示粗糙的钛合金微孔内部可见具有均匀多孔结构的水凝胶。第三部分:负载ADSCs水凝胶缓释英夫利昔促进RA中3D打印金属微孔界面的骨整合研究水凝胶体系可以实现英夫利昔的缓慢释放,28天内累计释放率为71.06%。复合体系具有良好的细胞相容性;细胞在水凝胶体系中呈类球形。模拟RA炎症微环境,评估各组细胞增殖水平。CCK-8实验表明:培养4,7和14天后,微孔金属界面/水凝胶/英夫利昔单抗组(MSHI组)的细胞增殖能力优于其他各组,差异有统计学意义。模拟RA炎症微环境,评估各组细胞成骨分化情况。ALP活性实验表明:培养4和7天后,MSHI组ALP水平高于其他各组,差异有统计学意义;茜素红染色和半定量结果表明:培养14和21天后,MSHI组矿化结节形成能力优于其他各组,差异有统计学意义;PCR结果表明:MSHI组Runx2、ALP、Osterix和Col-I表达水平优于其他各组,差异有统计学意义。将各复合体系植入RA模型动物股骨髁,术后12周评估关节炎症水平和内植物的骨整合能力。关节炎症水平:MSHI组和(微孔金属界面/水凝胶/英夫利昔单抗/ADSCs组)MSHIA组关节直径明显低于其他各组;MSHIA组TNF-α、IL-1、IL-6和卵清蛋白水平低于其他各组;MSHIA组和MSHI组滑膜炎症水平低于其他各组,差异有统计学意义。3D打印金属微孔界面的骨整合能力:micro-CT结果表明MSHIA组微孔金属界面的骨长入、骨密度和骨小梁结构优于其他各组;组织切片H&E染色结果表明:MSHIA组微孔金属界面周围新骨较多、结合紧密,其内部可见骨长入,明显优于其他各组;支架推出实验表明:MSHIA组支架把持力优于其他各组,差异有统计学意义。