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沙门菌是一种重要的食源性病原菌,绝大部分血清型对人和动物具有致病性,可引起多种不同临床表现的沙门菌病。研究沙门菌感染宿主的致病机制对预防和控制沙门菌病具有重要现实意义。细菌非编码小RNA(Small non-coding RNA,sRNA)是一类基因组中被转录但不编码蛋白质的RNA分子,通过感应外界环境变化,在转录后水平快速调节基因表达。RyhB是存在于沙门菌、大肠杆菌等多种细菌中的一种sRNA。沙门菌编码两种RyhB同源物:RyhB-1和RyhB-2,二者可参与铁代谢、能量代谢、硝酸盐代谢、氧化应激、耐酸性、耐药性等多种生命代谢过程的调控,但RyhB对毒力相关靶标基因的调控研究较少。本研究通过构建体外模拟肠道环境(Simulated Intestinal Environmentin vitro,SIE)模型,探究肠炎沙门菌在模拟肠道环境时RyhB的转录情况,筛选该条件下RyhB调控的毒力相关靶标基因,并对其调控机制及对宿主致病性作用进行深入研究。具体研究内容如下:1.低铁、无氧和模拟肠道环境对RyhB-1和RyhB-2转录的影响缺氧和铁匮乏是肠炎沙门菌及其它肠道菌感染宿主时必须面对的环境压力。为研究低铁、无氧和模拟肠道环境对RyhB转录的影响以及两种RyhB同源物之间的转录关系,本研究检测了肠炎沙门菌SE50336野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2双缺失株在低铁、无氧、模拟肠道环境下的生长情况,以及RyhB-1和RyhB-2的表达量。结果发现,与LB培养基中有氧培养条件下相比,低铁、无氧条件和模拟肠道环境培养条件下,所有沙门菌菌株生长缓慢;相同培养条件下,ryhB单缺失或双缺失均影响细菌生长。低铁、无氧和模拟肠道环境均可诱导RyhB-1和RyhB-2的高转录,尤其是模拟肠道环境下,二者表达量与常规培养条件相比分别升高70、60倍,表明RyhB-1和RyhB-2在沙门菌适应以上不良环境中发挥重要作用;单一ryhB缺失可导致另一RyhB 同源物表达量增加,推测两种RyhB同源物之间存在表达互补作用。2.模拟肠道环境下RyhB调控靶标基因的筛选为研究肠炎沙门菌自然感染宿主时RyhB的调控作用,通过转录组测序技术分析比较了模拟肠道环境条件下肠炎沙门菌野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2双缺失株的转录组变化,以筛选模拟肠道环境条件下RyhB调控的靶标基因。转录组测序结果显示,与野生株相比,ryhB-1、ryhB-2单缺失和双缺失株中分别有496、250、553个差异表达基因(Different Expression Genes,DEGs),其中受RyhB-1和RyhB-2共同调控的靶基因有363个,受RyhB-1单独调控的靶基因有188个,受RyhB-2单独调控的靶基因有110个。挑选了 14个差异表达基因,利用荧光定量PCR技术验证转录组测序结果的正确性。结果发现,荧光定量PCR检测基因的表达量与转录组测序结果趋势一致,表明转录分析数据可信度高,可继续下一步分析。GO分析结果显示,差异表达基因的分子功能主要富集到辅因子转运活性、亚铁血红素转运和ATP酶活性上,而生物过程和细胞组成主要富集到辅因子转运、亚铁血红素转运、蛋白质复合物生物合成与组装等功能上。KEGG分析结果显示,DEGs富集较多的通路包括硝酸盐代谢通路、双组份系统、信号转导和细菌侵袭上皮细胞等毒力相关基因。3.RyhB-1和RyhB-2对毒力相关靶基因的调控作用机制研究转录组测序结果发现,模拟肠道环境条件下,RyhB-1和RyhB-2可上调编码Ⅲ型分泌系统效应蛋白sipA和sopE基因的表达,抑制参与沙门菌在巨噬细胞内存活和复制的ssaI和sseA基因的表达。为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对以上靶基因的调控机制,本研究通过生物信息学预测RyhB与上述靶基因的结合位点,利用双质粒荧光报告系统证明调控机制(激活或抑制)。结果显示,RyhB-1和RyhB-2可直接与sipA mRNA的5’ UTR相互作用,使位于sipA mRNA 5’ UTR上原本闭合的核糖体结合位点(Ribosome Bind Site,RBS)暴露出来,促进翻译进程;RyhB-1和RyhB-2亦可直接与ssaI mRNA形成不完全互补配对,抑制ssaI翻译。而RyhB-1和RyhB-2对sopE和sseA基因起间接调控作用。4.RyhB-1和RyhB-2调控沙门菌侵袭和胞内存活与复制为进一步探究模拟肠道环境下RyhB对宿主致病性调控作用,通过MEAT(Murine Ex vivo Anaerobic Tissue,MEAT model)模型证明ryhB缺失后,肠炎沙门菌对小鼠肠道上皮细胞侵袭能力减弱,推测在自然感染宿主后,RyhB-1和RyhB-2被诱导转录,通过与sipA mRNA 5’ UTR相互作用,激活后者翻译,影响肠炎沙门菌对上皮细胞侵袭能力。巨噬细胞内存活试验表明,ryhB缺失导致肠炎沙门菌在巨噬细胞中存活能力减弱,但复制能力增强,推测RyhB-1和RyhB-2通过直接抑制参与肠炎沙门菌在巨噬细胞内存活与复制的效应蛋白SsaI表达,调控肠炎沙门菌在巨噬细胞内存活与复制。