胎盘正常形成发育与毛细血管发育关系密切,在正常妊娠中出现“两次生理性血管重铸”。妊高症(Pregnancy-induced hypertension,PIH)存在血管发生和功能障碍。VEGF作为重要血管生长因子之一,与受体Flt-1结合,在调节胎盘血管发育和PIH发病中发挥重要的作用,受多种因子调控,如:GH、leptin、NO、ET-1等。Ghrelin是神经内分泌调节因子,可刺激GH的分泌,改善内皮功能、增加内皮NOS合成和分泌,是内皮素的内源拮抗剂,能够刺激内皮细胞一氧化氮合成,进而改善内皮功能,舒张血管。目前,关于Ghrelin与VEGF及其受体Flt-1在胎盘组织中表达的相关性,以及Ghrelin是否通过调控VEGF及其受体Flt-1表达,进而调节血管舒张因子NO、NOS的释放,来参与胎盘血管形成发育还未见报道,本文首先利用免疫组化、实时荧光定量PCR、硝酸盐还原酶法检测正常妊娠胎盘组织中Ghrelin、VEGF、Flt-1基因表达的相关性及与血管活性因子NO及NOS释放量的关系;然后,利用反义寡核苷酸技术(Antisense oligonucleotide technology,ASODN)从细胞水平研究反义抑制Ghrelin后对VEGF、Flt-1、NO、NOS的调节作用;最后,联合上述技术研究了正常孕妇和妊高症孕妇胎盘中Ghrelin、VEGF、Flt-1、NO、NOS的关系,进一步深入探讨Ghrelin调节通路在妊娠胎盘血管形成发育及PIH发病机制中的作用。结果如下:1.Ghrelin与VEGF及其受体Flt-1在胎盘组织中表达的相关性(1)首先采用SP免疫组化法检测了Ghrelin与VEGF及其受体Flt-1在正常妊娠各期6-8周、9-10周绒毛、11-15周、16-20周和21-30周、31-38周胎盘组织中Ghrelin、VEGF、Flt-1蛋白水平的表达特点,蛋白定位检测结果显示,正常妊娠过程中不同孕期绒毛和胎盘组织中均有Ghrelin和VEGF、Flt-1蛋白表达,阳性颗粒主要定位在细胞滋养细胞、绒毛内血管内皮细胞和周围的间质细胞胞浆中。在妊娠不同阶段呈现动态变化,即在妊娠早期9-10周,妊娠16-20周阳性颗粒表达与其他阶段比较差异有显著性(p＜0.05),阳性信号明显增强,与两次“胎盘血管生理性重铸”时间相吻合,提示Ghrelin与VEGF、Flt-1在正常妊娠各阶段蛋白水平表达动态变化可能具有相关性。(2)然后,采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测妊娠6-8周、9-10周绒毛、11-15周、16-20周和21-25周、26-30周、31-38周胎盘组织中Ghrelin、VEGF、Flt-1 mRNA表达的变化,进一步证实:Ghrelin和VEGF、Flt-1 mRNA表达与上述蛋白表达具有相似的时空特异性,即在妊娠早期9-10周,妊娠16-20周呈现大幅度的增高,呈现两个表达高峰,与两次“胎盘血管生理性重铸”时间相吻合,从时空变化的角度验证了两者的相关性,说明在正常妊娠过程中胎盘Ghrelin、VEGF、Flt-1可能通过潜在的相互调节作用,参与胎盘血管的形成和发育。2.NO释放量及NOS活力在正常妊娠各期的变化规律为了探讨NO释放量及NOS活力在正常妊娠各期的变化规律,其变化规律与Ghrelin、VEGF的变化是否有关,采用硝酸盐还原酶法检测了NO、NOS在正常妊娠各期的释放水平的变化,结果提示:NO释放含量及NOS活力在正常妊娠各期呈现规律性变化,即在妊娠早期9-10周,妊娠16-20周、妊娠31-38周出现三次高峰,提示:NO和NOS释放量与Ghrelin、VEGF、Flt-1的表达有相关性,而孕晚期高峰的出现可能与分娩启动与子宫平滑肌松弛有关,可能由其他的调节机制影响。3.反义抑制Ghrelin对VEGF、Flt-1蛋白及mRNA表达以及NO、NOS释放水平的影响为了进一步验证Ghrelin、VEGF、Flt-1在胎盘血管形成发育过程中相互作用机制,利用反义寡核苷酸技术反义抑制Ghrelin转录,从细胞水平检测Ghrelin对体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中VEGF及其受体Flt-1蛋白及mRNA表达以及NO、NOS释放水平的影响,通过改变体外培养的反义寡核苷酸浓度和培养的不同时间确定最佳抑制Ghrelin条件为:浓度20μmol/L、培养时间:36h。有效抑制Ghrelin转录,检测Ghrelin对HUVEC中VEGF、Flt-1蛋白和mRNA表达的影响。结果显示:反义抑制Ghrelin后VEGF、Flt-1蛋白和mRNA的表达均下降,与空白对照组和SCON组比较均有显著性差异(p＜0.05);NO释放量与NOS活力在反义抑制Ghrelin后释放水平也显著下降(p＜0.05)。体外研究证明,反义抑制HUVECGhrelin后可下调VEGF,Flt-1蛋白和mRNA的表达,同时下调NO释放量和NOS活力水平。4.在以上实验的基础上,为探讨Ghrelin在PIH孕妇发病过程中的作用,联合采用免疫组化法、RQ-PCR、硝酸盐还原酶法技术检测了Ghrelin、VEGF、Flt-1及NO、NOS在正常孕妇与PIH孕妇胎盘的表达情况。结果证实:PIH孕妇胎盘组织中Ghrelin,VEGF、Flt-1蛋白和mRNA水平下降与正常孕妇比较有显著性差异(p＜0.05);提示在PIH发病过程中Ghrelin可能对VEGF,Flt-1蛋白和mRNA的表达具有下调作用,进而影响胎盘血管网的形成和发育;NO含量与NOS活力水平在PIH孕妇胎盘组织中下降,提示Ghrelin可能通过下调VEGF的表达进一步影响血管舒张因子NO水平下降,进而引起胎盘血管痉挛,血压升高,最终导致PIH的发生。综合以上分析,本研究利用免疫组化、实时荧光定量PCR、细胞培养、反义寡核苷酸、硝酸盐还原酶技术检测了Ghrelin、VEGF、Flt-1及NO、NOS在正常妊娠与PIH孕妇胎盘以及反义抑制Ghrelin体外培养HUVEC中的表达情况,研究结果充分表明:Ghrelin与VEGF、Flt-1及NO、NOS在正常妊娠各阶段的表达具有相似的时空特异性,并与两次“胎盘血管生理性重铸”时间相吻合,推测Ghrelin在妊娠胎盘血管形成和发育中可能具有一定的作用;反义抑制HUVEC Ghrelin后可下调VEGF,Flt-1蛋白和mRNA的表达,同时下调NO释放量和NOS活力水平;PIH孕妇胎盘组织中Ghrelin,VEGF、Flt-1蛋白和mRNA水平以及NO释放量与NOS活力水平明显下降。以上结果说明,Ghrelin在正常妊娠胎盘血管形成发育以及PIH疾病发病中具有一定的作用,这为深人探讨Ghrelin在生殖和临床妇产科疾病的发生、发展及治疗提供了一个可能的新的研究方向。