1目的支气管哮喘（简称哮喘）是一种呼吸系统常见病，是由嗜酸细胞（EOS）、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性气道变态反应性炎症，并由此导致患者的气道高反应性（AHR），从而引起气道阻塞，气流受限。近二十年来，哮喘病的发病率和死亡率在世界范围内呈逐年上升趋势，严重危害着人们的生命健康和生存质量。因此，对哮喘的发病机制及其防治方法进行深入的研究有着重要的意义。本课题以组胺激发以及卵蛋白（OVA）致敏和攻击复制豚鼠哮喘模型，探讨五味地龙汤对豚鼠哮喘模型在体、离体气管平滑肌、肺泡灌洗液（BALF）中EOS数量、肺组织形态学，以及血清白三烯B₄（LTB₄）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）等的影响，从变态反应、气道炎症、气道重塑等方面探讨其止哮平喘的作用机制，为临床开发有效的哮喘治疗药物提供依据。2材料与方法2．1材料2．1．1动物：取体重200-300 g豚鼠，♀♂各半，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：syxk（鄂）2004-0028。2．1．2药物制备：五味地龙汤组成：：炙麻黄5g、地龙5g、鱼腥草10g、柴胡10g、葶苈子10g、射干10g、五味子10g、细辛5g、蜂房5g、甘草10g。小青龙汤组成：麻黄6g、白芍6g、细辛6g、干姜6g、炙甘草6g、桂枝6g、半夏6g、五味子6g。将上两方加水煎煮三次合并后过滤，滤液水浴浓缩至五味地龙汤原生药含量为2.88g·ml^-1，小青龙汤原生药含量0.86g·ml^-1，低温（4℃）放置备用。临用时用蒸馏水稀释，五味地龙汤大剂量组2.88g·ml^-1，五味地龙汤中剂量组1.44g·ml^-1，五味地龙汤低剂量组0.72g·ml^-1。2．1．3主要试剂：磷酸组胺；卵白蛋白，Sigma公司（USA）；氢氧化铝；豚鼠LTB₄试剂盒，RapidBio Lab．California（USA）；豚鼠IFN-γ试剂盒，RapidBio Lab．California（USA）；豚鼠IL-4试剂盒，RapidBio Lab．California（USA）。2．2方法2．2．1动物模型复制2．2．1．1磷酸组胺激发致喘法：用于实验一观察五味地龙汤对豚鼠吸入组胺致喘的影响。2．1．1．2卵蛋白（OVA）致敏法：给豚鼠一次性腹腔注射10％OVA（含10％氢氧化铝）生理盐水1.0ml致敏，并于第15d用1％OVA生理盐水喷雾吸入致喘，每次喷雾时间为30s，以后每隔1d喷雾一次，连续8d。用于实验二至实验六。2．2．2动物分组及指标检测2．2．2．1实验一五味地龙汤对豚鼠吸入组胺致喘的影响。取豚鼠40只，随机分为5组，抗原对照组、五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤中剂量组、五味地龙汤小剂量组、氨茶碱组，每组8只。其中药物处理各组分别ip相应药物均为3ml。氨茶碱组ip氨茶碱125mg·kg^-1，抗原对照组ip相同量的生理盐水。30 min后，各组分别测定其引喘潜伏期及6 min内跌倒的只数。2．2．2．2实验二观察五味地龙汤对致敏豚鼠离体气管平滑肌过敏性收缩的影响。取豚鼠40只，动物分组同实验一。用卵蛋白致敏法造模。于造模后第23d麻醉动物，放血处死，取出气管段，按离体气管装置进行描记。记录各组动物抗原攻击后离体气管条收缩曲线高度的差值。2．2．2．3实验三观察五味地龙汤对哮喘豚鼠BALF中EOS和肺支气管组织形态学的影响。取豚鼠48只，随机分为6组：正常对照组，哮喘模型组，地塞米松（阳性药物）组，小青龙汤组，五味地龙汤大剂量组，五味地龙汤小剂量组，每组8只。哮喘豚鼠模型复制同实验二。喷雾引喘当天开始，各引喘豚鼠分组ig给予相应药物3ml治疗，每日一次，连续8 d。其中哮喘模型组只致敏不给药，正常对照组用等量的生理盐水处理动物。于第23 d麻醉动物，分离颈动脉，取颈动脉血静置2 h以上，以3000 r·min^-1离心10 min，取血清，放置低温冰箱中备用。实验过程中观察豚鼠一般情况，将麻醉取血后的动物进行肺泡灌洗（BAL），回收BALF，染色后进行EOS计数，并用肉眼和光镜观察肺、支气管组织形态学变化。2．2．2．4实验四、五、六分别观察五味地龙汤对哮喘豚鼠血清LTB₄、IFN-γ、IL-4的影响。实验动物分组、造模、处理同实验三。按LTB₄、IFN-γ、IL-4等相关试剂盒说明进行操作检测上述血清指标。2．3统计学方法各组数据均以（?）±s表示，采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理，组间均数比较采用方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义。3结果3．1实验一：五味地龙汤对豚鼠吸入组胺致喘的影响。给药前各组豚鼠潜伏期无明显差异（P＞0.05）。与对照组比较，给药后五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤中剂量组、氨茶碱组豚鼠哮喘潜伏期明显延长（P＜0.01），五味地龙汤小剂量组豚鼠哮喘潜伏期也有延长（P＜0.05）。3．2实验二：五味地龙汤对致敏豚鼠离体气管平滑肌过敏性收缩的影响。五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤中剂量组、氨茶碱组收缩曲线高度差值与对照组比较（P＜0.01），五味地龙汤小剂量组收缩曲线高度差值与对照组比较（P＜0.05）。3．3实验三：五味地龙汤对哮喘豚鼠BALF中EOS和肺支气管组织形态学的影响。3．3．1 BALF中EOS计数结果：哮喘模型组BALF中EOS数明显增加。五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤小剂量组、地塞米松组、小青龙汤组的EOS与哮喘模型组EOS比较，差异均有非常显著的统计学意义（p均＜0.01）。五味地龙汤大剂量组和地塞米松组与正常对照组EOS比较，差异均无统计学意义（p均＞0.05）。3．3．2肺组织肉眼形态观察：正常对照组：肺颜色淡红，肺组织柔软而有弹性，表面光滑。哮喘模型组：肺过度膨胀，部分肺组织颜色变深，呈暗红色，质稍硬，表面有瘀点、呈颗粒状。药物治疗组肺脏组织形态学变化：肺组织颜色稍暗，膨胀不明显，无瘀斑瘀点。3．3．3光镜观察：模型组见支气管粘膜上皮局灶性脱落，黏膜下层充血水肿，嗜酸性粒细胞灶状浸润，其内夹少许淋巴细胞、单核细胞、浆细胞。腔内可见部分黏液及渗出物，黏膜下平滑肌显著增生肥厚。地塞米松组：气管管壁结构正常，受损黏膜上皮逐渐恢复，黏膜下层炎性水肿减轻，管腔基本干净。支气管管腔结构完整，受损黏膜上皮逐渐修复，管腔完整，无炎性渗出。小青龙汤组：气管黏液上皮杯状细胞增生，黏膜下层见轻度充血水肿及少量炎症细胞，管腔内见炎性渗出物。管腔内见少许脱落的上皮细胞，粘膜增生，基层轻度肥厚。五味地龙汤大剂量组：气管管壁结构逐渐恢复，炎症减轻，水肿明显消失。管腔炎性渗出物明显减少。支气管管壁结构基本正常，黏膜上皮逐渐修复，黏膜下层水肿明显减轻，管腔恢复正常。无炎性渗出。五味地龙汤小剂量组：气管结构层次清楚，受损黏膜上皮细胞逐渐恢复，管腔内仍有部分炎性渗出物。支气管管壁结构完整，增生肥大的平滑肌上皮细胞逐渐恢复正常，管腔渗出物逐渐吸收。3．4实验四：五味地龙汤对哮喘豚鼠血清LTB₄的影响。各组豚鼠血清LTB₄含量与哮喘模型组血清LTB₄含量比较，差异均有非常显著的统计学意义（p均＜0.01），与正常对照组血清LTB₄含量比较，差异均无统计学意义（p均＞0.05）。3．5实验五：五味地龙汤对哮喘豚鼠血清干扰素-γ水平的影响。五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤小剂量组、小青龙汤组、地塞米松组血清IFN-γ含量与哮喘模型组血清IFN-γ含量比较，差异均有非常显著的统计学意义（p均＜0.01）。五味地龙汤小剂量组、小青龙汤组血清IFN-γ与五味地龙汤大剂量组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）；与地塞米松组比较，亦有显著差异（p＜0.01）；五味地龙汤大剂量组血清IFN-γ与地塞米松组比较，差异也具有显著的统计学意义（p＜0.01）。3．6实验六：五味地龙汤对哮喘豚鼠血清白细胞介素-4水平的影响。五味地龙汤大剂量组、五味地龙汤小剂量组、地塞米松组血清IL-4含量与哮喘模型组血清IL-4含量比较，差异均有显著的统计学意义（p均＜0.01）。小青龙汤组血清IL-4含量，与哮喘模型组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。各药物组与正常对照组血清IL-4含量比较，均无统计学意义（p均＞0.05）。正常对照组与哮喘模型组血清IL-4含量比较，差异有显著的统计学意义（p＜0.01）。4结论4．1以卵蛋白致敏和攻击，诱发豚鼠气道变态反应，可以成功复制豚鼠哮喘模型。4．2哮喘发病与风、痰等因素密切相关。外风伤肺，内风扰肺，外风引动内风、痰浊，是哮病发作的根本原因。风盛痰阻、气道挛急是哮喘急性发作的主要病机，风、痰、气、瘀、虚、肝肺功能失调是哮喘发作期的基本病机特点。治疗当以祛风止哮，降气化痰与调理脏腑并重。4．3五味地龙汤有祛风止哮、化痰平喘作用，用于治疗哮喘疗效确切。4．4五味地龙汤治疗哮喘的作用机制。4．4．1对气道变态反应的影响。不同剂量的五味地龙汤能对致敏豚鼠在体、离体气管平滑肌过敏性收缩有显著的抑制作用，并能使豚鼠哮喘潜伏期延长。还能明显升高哮喘动物血清IFN-γ的水平，明显降低哮喘动物血清IL-4的水平。提示五味地龙汤可能通过升高哮喘豚鼠血清IFN-γ的水平、降低血清IL-4的水平等，调节辅助性T细胞相关细胞因子的比例，进而调节免疫平衡，抑制IgE合成，发挥解痉平喘作用。4．4．2对气道炎症的影响。五味地龙汤能减轻哮喘豚鼠气道EOS浸润，减少炎性介质LTB₄的释放，降低血清中IL-4水平、升高血清中IFN-γ的水平，间接调节Th1／Th2细胞平衡等，改善气道高反应性。其在抗气道炎症作用方面部分相当或接近地塞米松的治疗作用，提示其解痉平喘作用途径在改善气道高反应性方面具有优势。4．4．3对气道重塑的影响。肺组织形态学观察结果显示，模型对照组支气管粘膜上皮局灶性脱落，黏膜下层充血水肿，嗜酸性粒细胞灶状浸润，黏膜下平滑肌显著增生肥厚。与正常对照组相比，模型对照组出现气道重塑病理。经五味地龙汤治疗，气管管壁结构逐渐恢复，炎症减轻，水肿明显消失，增生肥大的平滑肌上皮细胞基本或逐渐恢复正常。提示五味地龙汤具有抑制哮喘豚鼠气道重塑，从而发挥平喘作用。其机制可能是通过减少气道EOS浸润，减少炎症介质分泌、释放，减轻炎性渗出，抑制杯状细胞和平滑肌细胞增生，从而减轻气道炎症反应，抑制气道重塑。4．5五味地龙汤对哮喘豚鼠的止哮平喘作用，具有剂量依赖关系，并且部分作用优于传统止哮方剂小青龙汤，其机制值得进一步深入研究，可以为下一步的研究提供思路。