【摘 要】
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背景:糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulcer,DFU）是糖尿病常见并发症,严重影响患者生活质量。研究认为NLRP3过度活化介导的炎症反应是导致DFU创面愈合困难的重要原因。兰科植物白及是我国传统中药,可用于各类创伤治疗。近期研究表明白及多糖（Bletilla striata polysaccharide,BSP）对DFU具有治疗作用,但其分子机制不明。目的:观察BSP对DFU的治疗作
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背景:糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulcer,DFU）是糖尿病常见并发症,严重影响患者生活质量。研究认为NLRP3过度活化介导的炎症反应是导致DFU创面愈合困难的重要原因。兰科植物白及是我国传统中药,可用于各类创伤治疗。近期研究表明白及多糖（Bletilla striata polysaccharide,BSP）对DFU具有治疗作用,但其分子机制不明。目的:观察BSP对DFU的治疗作用,并研究其作用机制是否与溃疡区巨噬细胞NLRP3炎症小体调控作用有关。方法:采用水提醇沉法制备BSP,然后使用酶标仪对BSP进行紫外波段吸收扫描,采用苯酚-硫酸法和BCA法分别对BSP中总糖含量和蛋白质残留量进行检测;使用高效凝胶渗透色谱法对BSP相对分子量等参数进行测定;使用HPLC法和IC法对BSP单糖组成情况进行分析;使用傅里叶变换红外光谱对BSP吸收特征进行分析。在整体动物水平实验中,采用高脂饲料喂养结合低剂量链脲佐菌素注射法建立糖尿病（Diabetic mellitus,DM）小鼠模型,使用皮肤活检器在DM小鼠后背部造成切除伤口以建立DFU模型。将DFU模型小鼠随机分为两组,分别给予生理盐水和BSP外用涂抹处理;使用的BSP浓度为5%（w/w,溶于生理盐水）,每个创面使用量为50μL,每天给药1次。正常对照组小鼠接受生理盐水处理作为对照。各组动物连续给药12 d,治疗期间检测体重和血糖变化,并每隔2 d对创面愈合情况进行拍照记录。末次给药结束后,以腹腔注射乌拉坦方式麻醉各组小鼠,然后收集血液样本,分离血清后用于TC、TG、HDL-C、LDL-C、Insulin、IL-1β和TNF-α含量检测;剪取各小鼠皮肤创面组织并冻存,用于组织IL-1β和TNF-α含量分析、CD68和CD31免疫组化分析和TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β表达水平的Western blot分析。分离和培养小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages cells,BMDMs）和心肌微血管内皮细胞（Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs）,并以高糖（High glucose,HG）高胰岛素处理法建立细胞模型。分别观察BSP对BMDMs活力、ROS水平、IL-1β的分泌量及细胞内NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响;BSP对CMECs活力、ROS水平及胞内胰岛素传递信号相关蛋白的表达及其磷酸化的影响;BSP对BMDMs-CMECs共培养体上述相关指标的影响以及加入外源性IL-1β对BSP作用的影响。结果:BSP收率为24.5%,多糖含量为99.21%,样品中不含核酸成分,无蛋白检出;BSP主要由甘露糖和葡萄糖两种单糖构成,其比例约为1.84∶1.00。在动物实验中,BSP给药处理可加快DFU创面愈合,抑制巨噬细胞浸润并促进血管生成;生化分析结果显示BSP干预可降低溃疡区IL-1β和TNF-α含量,但对血清中的其它检测指标水平没有影响;Western blot结果表明BSP可抑制溃疡区NLRP3炎症小体过度活化并提高溃疡区胰岛素敏感性。离体细胞实验结果表明,BSP干预处理可缓解HG刺激导致的BMDMs内ROS水平上升、NLRP3炎症小体过度活化和IL-1β释放量增多以及CMECs活力下降及胞内胰岛素信号传导受损;BMDMs-CMECs共培养实验结果提示BSP干预对两种细胞的上述异常情况均有保护作用,而加入IL-1β可抑制BSP的上述作用。结论:BSP促DFU愈合作用可能与其抑制溃疡区巨噬细胞NLRP3炎症小体过度活化有关。
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