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研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,虽然治疗方法多样,但其死亡率仍然居高不下。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型。厄洛替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI),它作为一个晚期EGFR驱动基因阳性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者一线治疗的首选药物,其使用明显提升此类患者的临床结局。但经历约10月的中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)后,EGFR-TKI耐药不可避免成为临床常见的难题之一。至今,已提出MET扩增、ERBB2扩增、K-RAS突变或PTEN缺失等多种机制参与EGFR-TKI耐药,但仍有一些机制不明。因此,进一步探讨厄洛替尼耐药是需要解决的重要问题。本研究通过Gene expression omnibus(GEO)数据库预测了鸟苷酸结合蛋白1(guanylate binding proteinl,GBP1)可能是一个与厄洛替尼耐药相关的癌基因。通过单因素和多因素回归分析确认GBP1与NSCLC患者预后差相关。接着我们通过逐级增加厄洛替尼浓度增加而建立厄洛替尼耐药株,并使用这些细胞分析沉默或过表达GBP1和厄洛替尼耐药的关系,从而确认GBP1参与厄洛替尼耐药。为了探索GBP1在厄洛替尼耐药中具体作用机制,我们进行免疫共沉淀实验和免疫荧光共定位实验分析GBP1和磷酸甘油激酶1(phosphoglycerol kinase 1,PGK1)是否存在互作关系。最后,我们探索PGK1参与厄洛替尼耐药的下游信号通路,通过回复和免疫组化(IHC)实验证实GBP1通过PGK1激活上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。研究目的1,体内、体外实验探讨GBP1是否参与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。2,探讨GBP1参与调控非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的分子机制。3,探讨GBP1表达与非小细胞肺癌患者生存、临床特征的关系。研究方法第一部分体外研究1 GBP1参与厄洛替尼耐药的实验1.1细胞毒性实验(CCK-8)比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞的半数抑菌浓度(IC50)。1.2荧光定量PCR实验(qRT-PCR)比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞GBP1基因的mRNA水平。1.3 Mann-Whitney检测GBP1的mRNA水平与厄洛替尼耐药的相关性。1.4 T790M位点突变检测试剂盒检测耐药细胞是否存在T790M位点突变。1.5利用单因素和多因素Cox回归分析非小细胞肺癌总生存时间和临床特征的关系。2体外研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药的实验2.1 CCK-8实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的IC50值。2.2蛋白质免疫印迹实验(WB)比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的蛋白表达2.3 qRT-PCR实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的mRNA水平。2.4 免疫荧光试验探讨与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib组GBP1、PCNA荧光值变化。2.5 CCK-8实验分析不同浓度厄洛替尼作用下,PC9ER-shGBP1+erlotinib组与PC9ER--NC+erlotinib 组间的 IC50值。2.6流式凋亡实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的晚期凋亡细胞占比。2.7WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组凋亡标志物Bax、Bcl-2和cleaved PARP1蛋白表达变化。2.8流式细胞周期实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的G1期占比。2.9 WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组细胞周期标志物P21、Cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达变化。第二部分体内研究1体内研究过表达GBP1实验1.1 裸鼠成瘤实验比较 PC9ER-NC+erlotinib 组和 PC9ER-shGBP1+erlotinib 组间的移植瘤大小、重量。1.2 裸鼠成瘤实验比较 PC9-NC+PBS 组、PC9-NC+erlotinib 组、PC9-GBP1+PBS组、PC9-GBP1+erlotinib组的移植瘤大小、重量。1.3 IHC实验检测小鼠肿块GBP 1、PCNA以及凋亡蛋白的表达。2体内研究过表达GBP1组GBP1的WB和qRT-PCR实验2.1 qRT-PCR 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间GBP1的mRNA水平。2.2 WB 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间 GBP 1蛋白表达变化。2.3 IHC实验检测小鼠肿块PC9-NC+erlotinib组与 PC9-GBP1+erlotinib组间 P21、Cyclin D1蛋白的蛋白表达变化。第三部分 机制探讨1 GBP1和PGK1互作的实验1.1 质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白。1.2 免疫共沉淀实验分析GBP1和PGK1的互作关系。1.3 免疫荧光实验检测GBP1和PGK1共定位关系。1.4 WB实验分析GBP1和PGK1的蛋白调控关系。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药的实验2.1 WB实验检测与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组、耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1组EMT相关蛋白的表达变化。2.2 CCK-8实验检测耐药细胞沉默PGK1组与对照组间的IC50值。2.3 qRT-PCR实验检测耐药细胞与敏感细胞间E-cadherin的mRNA水平。2.4 CCK-8实验检测耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组间的IC50值。2.5 WB实验分析PGK1和Twist的关系。2.6 IHC 实验分析了小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间的EMT相关蛋白的表达变化。第四部分 临床意义非小细胞肺癌中高表达GBP1与预后、临床数据的关系分析1 Kaplan-Meier生存分析GBP1和PGK1表达水平与总生存时间的关系。2 cBioportal数据库分析GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平的相关性。3 Oncomine数据分析非小细胞肺癌GBP1表达与临床数据的相关性。研究结果第一部分GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义1 GBP1参与厄洛替尼耐药1.1与敏感细胞株相比,厄洛替尼在耐药细胞株PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975 的 IC50值升高。1.2 与敏感细胞株相比,PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975中GBP1的mRNA水平升高。1.3 Mann-Whitney检验发现高表达的GBP1与厄洛替尼耐药性增强相关。1.4 PC9ER 及 HCC827ER 中未发现 T790M 突变。1.5单因素分析与多因素分析结果表明,与总生存时间相关的因素是治疗后肿瘤情况、GBP1表达水平。2体外研究表明GBP1调控厄洛替尼耐药2.1与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1蛋白表达减低。2.2与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1的mRNA水平减低。2.3与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组的IC50值减低。2.4 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,GBP1、PCNA 在 PC9ER-shGBP1+erlotinib组有弱的荧光值。2.5在相同浓度的厄洛替尼作用下,与PC9ER-NC+erlotinib组比较,PC9ER-shGBP 1+erlotinib组的细胞存活率减低。2.6与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的晚期凋亡细胞占比增高。2.7与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1时Bcl-2和PCNA的蛋白表达减低,Bax和cleaved PARP1的蛋白表达增高。2.8与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的G1期占比增高。2.9与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的P21蛋白表达增高,Cycilin D1、CDK4和CDK6的蛋白表达减低。以上结果表明GBP1在厄洛替尼耐药细胞高表达,且提升的GBP1通过促进凋亡,增加细胞G1期比例调控厄洛替尼耐药。第二部分体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药1过表达GBP1促进厄洛替尼耐药性1.1 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib 组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.2与PC9-NC+erlotinib组比较,PC9-GBP1+erlotinib组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.3 与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组的 GBP1、PCNA 和 Bcl-2蛋白表达升高,而cleaved PARP1蛋白表达减低。2过表达GBP1减少细胞周期G1期占比2.1 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 的mRNA水平升高。2.2 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 蛋白表达升高。2.3 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 P21 蛋白表达减低,Cyclin D1蛋白表达增高。以上结果表明在体内研究中,过表达GBP1增加厄洛替尼耐药性,减少细胞G1期比例。第三部分GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药1 GBP1和PGK1之间存在互作1.1质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白有MYL9、ANXA2、ALDOA、PGK1等。1.2免疫共沉淀实验(CoIP)确认GBP1和PGK1的互作关系。1.3免疫荧光实验确认GBP1和PGK1的共定位关系。1.4 GBP1在蛋白水平调控PGK1蛋白表达。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药2.1耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1,能回复耐药细胞沉默GBP1对EMT相关蛋白的影响。2.2耐药细胞沉默PGK1组与对照组比较,IC50值减低。2.3耐药细胞与敏感细胞相比,E-cadherin的mRNA水平减低。2.4耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组比较,IC50值增高。2.5 PGK1促进Twist蛋白表达。2.6 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 PGK1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达增高,而E-cadherin蛋白表达减低。以上结果表明GBP1通过PGK1激活的EMT通路调控厄洛替尼耐药。第四部分GBP1表达与患者预后、病理分级的关系非小细胞肺癌中高表达GBP1与差的预后、高的肿瘤分级相关1高表达GBP1、PGK1的患者总生存时间和首次进展时间缩短。2 GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平呈正相关。3非小细胞肺癌患者的病理分级与GBP1表达呈显著正相关。以上结果表明GBP1的高表达提示非小细胞肺癌患者差的预后、高的病理分级。研究结论本研究发现在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株中,GBP1无论蛋白表达还是mRNA水平均明显提高。而且GBP1水平提高使厄洛替尼敏感细胞在体内及体外获得对厄洛替尼的耐药性。同时上调的GBP1能减少凋亡相关蛋白的表达,并诱导细胞G1期向S期转换。GBP1和PGK1互作且通过EMT信号通路参与厄洛替尼耐药调控。利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库发现高表达GBP1提示总生存时间和首次进展时间缩短。总之,我们利用细胞株、动物模型和临床样本证明GBP1表达变化调控厄洛替尼耐药,提示在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中靶向GBP1可能是一个潜在的治疗干预靶点。