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功能蛋白质组学可以比较不同样品之间蛋白质整体表达水平,其敏感性、高效性,以及结果的可靠性和重复性都是传统的方法无可比拟的。近年来功能蛋白质组学已广泛运用于研究各蛋白质的相互作用及蛋白鉴定,也成为研究缺血/低氧适应及损伤细胞信号转导通路的理想工具。据此,本研究拟利用小鼠整体HPC模型及蛋白质组学技术进一步鉴定HPC小鼠大脑皮层组织内与nPKCε相互作用的蛋白。所获研究结果将进一步丰富人们对脑 I/HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。实验动物随机分为常氧对照(Con)及HPC(低氧暴露4次)组,按我室已建方法制备自然低氧诱导的小鼠整体低氧预适应模型。低氧结束后,断头处死小鼠,分离大脑皮层组织,并迅速放到液氮内冻存备用。取上述冻存的脑组织加入组织裂解液提取胞浆及膜相关蛋白成分,利用nPKCε抗体进行免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)后,进行双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离。所得 2-DE 凝胶硝酸银染色后利用 ImageMaster 2DPlatinum 软件进行图像分析。与对照组比较,选取HPC 组小鼠大脑皮层内蛋白表达水平发生明显改变的点为目标蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-associated laser desorptionPionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行检测,获得的混合物肽片段质量指纹图谱用Swiss-prot 数据库搜索进行蛋白鉴定,并应用 PANTHER(Protein ANalysis THroughEvolutionary Relationships)蛋白分类系统,根据分子功能及参与的生理过程的不同,将鉴定出的蛋白进行分类。最后应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法,进一步验证HPC小鼠脑内与nPKCε相互作用蛋白的差异表达情况。Western blot 结果应用Quantity One 软件进行半定量分析。所有实验数据通过独立样本t检验进行统计学分析,并以均数±标准差((x)±s)表示。其中p<0.05为差异显著。
实验结果如下:
1.随着低氧暴露次数的增加,小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长与低氧暴露1次(H1,17.1±2.1min)相比,重复低氧暴露2次(H2,28.6±0.6min)、3次(H3,33.2±1.2min)和4次(H4,35.0+0.9min)小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05,n=50),提示本实验成功地制备了小鼠HPC模型。以下HPC小鼠特指低氧暴露4次组小鼠。
2.HPC小鼠大脑皮层组织内nPKCε相互作用蛋白明显改变在对照组和HPC组小鼠皮层胞浆和膜相关蛋白成分中均可检测到与nPKCε相互作用的蛋白点,且重复性较好。将对照组和HPC组小鼠大脑皮层组织内nPKCε相互作用蛋白2-DE图谱进行硝酸银染色后,利用ImageMaster 2D Platinu氧的利用和调节是高等生物生存的基本条件,而低氧性损伤和适应参与了许多病理生理过程及一些疾病的发生,如窒息、高原反应、缺血、脑中风、心肌梗死,以及癌细胞耐药和转移等。缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxicpreconditioning,I/HPC)作为一种内源性保护机制,指的是亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。该现象最初由美国学者Murry于1986年在心脏组织中发现,随后人们又在脑、肺、肝和肾等组织器官中均观察到了类似现象。对I/HPC形成机制的研究尤其是对参与脑I/HPC形成的细胞信号传导通路的研究,可为临床治疗缺血/低氧损伤开辟新思路。利用已建立小鼠整体HPC模型,我们以往的研究表明,随着低氧暴露次数的增加,小鼠低氧耐受时间明显延长,并且蛋白激酶C(Protein kinase C,PKCs)家族的10个亚型中,新奇型PKCε(nPKCε)膜转位水平(激活程度)在脑组织内明显增高,提示它可能参与了小鼠脑 HPC的发生发展过程。然而,究竟哪些蛋白可能与nPKCε相互作用参与该过程,至今仍不清楚。软件进行图像分析比较发现,HPC小鼠大脑皮层胞浆成分中有54个蛋白点有表达量上的差异,其中34个蛋白点上调,20个蛋白点下调；而在膜相关成分中,有56个蛋白点的表达量有改变,其中27个蛋白点上调,28个蛋白点下调。
3.差异表达的nPKCε相互作用蛋白的质谱鉴定
目标蛋白点利用MALDI-TOF-MS 进行检测,并通过Swiss-prot数据库搜索鉴定后发现,在HPC小鼠大大脑皮层胞浆成分中鉴定出的15个蛋白中有10个上调,5个下调；膜相关成分中鉴定出的24个蛋白中有11个上调,13个下调。
4.差异表达的nPKCε相互作用蛋白功能分类
应用 PANTHER.蛋白分类系统,将上述已鉴定出的蛋白进行分类后发现,按参与的生理过程的不同,在胞浆和膜相关蛋白组分中,均存在多个糖代谢相关蛋白、应激蛋白和细胞骨架蛋白等与nPKCε存在相互作用。按分子功能的不同,胞浆和膜相关蛋白组分中与nPKCε存在相互作用的蛋白包括热休克蛋白家族、Tubulin和G蛋白水解酶类等。
5.Western blot 验证部分差异表达的nPKCε相互作用蛋白
借助Western blot发现,HPC小鼠大脑皮层胞浆和膜相关成分中与nPKCε相互作用的HSP70和14-3-3γ表达量均明显升高(p<0.05,n=3),而与nPKCε相互作用的HSP60仅在膜相关成分中升高(p<0.05,n=3)。
综上所述,本研究借助蛋白质组学技术与整体HPC 小鼠模型证实,nPKCε可能通过调节HSP60、HSP70和14-3-3γ等多种相互作用的蛋白参与脑HPC的形成。所获成果不仅丰富了人们对脑I/HPC 信号转导机制的认识,而且为我们后续探讨参与脑HPC 神经保护作用相关的nPKCε信号网络奠定了基础。