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目的目前急性心梗最有效的治疗方式是及时恢复心肌血流灌注，而再灌注本身加剧心脏内促炎反应，造成额外的心肌损伤。调节性固有淋巴细胞(ILCreg)是一种具有抗炎功能的固有淋巴细胞，本研究的目的是探讨ILCreg细胞对小鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响。
方法1.体视显微镜下寻找冠状动脉左前降支，予结扎阻断血流30分钟再解开结扎线，恢复血流灌注建立小鼠MIRI模型,假手术(Sham)组除不结扎缝线外其余处理均相同。Evansblue/TTC心脏染色、血清心肌肌钙蛋白T(cTnT)检测和心脏超声评估心功能以验证MIRI模型是否成功。流式细胞术检测Sham组和再灌注后不同时间点(12小时、24小时、72小时)心脏及脾脏中ILCreg细胞在淋巴细胞中的比例。流式细胞术检测健康成年小鼠心脏和脾脏中ILCreg细胞数目。
2.使用Id3flox/floxId2-creERT2小鼠，予腹腔注射他莫昔芬诱导清除ILCreg细胞，作为ILCregKO组；Id2-creERT2小鼠予腹腔注射他莫昔芬作为给药对照组；WT小鼠作为野生型对照组，各组均予缺血30分钟，再灌注24小时构建MIRI模型。Evansblue/TTC染色检测心脏梗死面积，心脏超声评估心功能，电化学发光法检测小鼠血清cTnT水平，免疫组化染色(IHC)检测心肌组织中性粒细胞密度。
3.使用IL-10-GFP报告基因小鼠，从小肠中消化富集固有淋巴细胞(ILCs)，使用白介素2(IL-2)和转化生长因子β1(TGF-β1)体外培养扩增后，流式分选出ILCreg细胞，与原代心肌细胞共培养，使用H2O2诱导心肌细胞凋亡，流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例，实时荧光定量PCR(qPCR )和免疫印迹实验(Western Blot)分别检测心肌细胞Bax、Bcl-2mRNA和蛋白表达。
结果1.健康成年小鼠心脏中ILCreg细胞平均数目为(1.75±0.71)×102，脾脏中ILCreg细胞平均数目为(1.89±0.83)×103。随再灌注时间的延长，心脏中ILCreg细胞的比例于再灌注24小时显著升高(P＜0.001，n=9)，于72小时下降至基础水平，脾脏中ILCreg细胞的比例也于再灌注24小时显著升高(P＜0.0001，n=9)，于72小时下降至基础水平。
2.再灌注24小时，ILCregKO组小鼠的心脏梗死面积、左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)、血清cTnT水平和心肌组织中性粒细胞密度与给药对照组相比均无显著差别(P＞0.05，n=6)。
3.体外条件下，ILCreg细胞减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡，H2O2刺激后，同ILCreg细胞共培养的原代心肌细胞与对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均明显降低(P＜0.05，n=3)。作用机制上，ILCreg细胞可抑制H2O2刺激所致心肌细胞Bax与Bcl-2mRNA表达量比值和蛋白表达量比值的升高(P＜0.05，n=3)。
结论心脏和脾脏中ILCreg细胞在MIRI过程中反应性增加，在体清除ILCreg细胞对MIRI的严重程度没有明显影响，也不影响心肌组织中性粒细胞浸润。体外培养的ILCreg细胞表现出一定的抗心肌细胞凋亡作用，并可能通过调节Bax和Bcl-2的表达而发挥效应。
方法1.体视显微镜下寻找冠状动脉左前降支，予结扎阻断血流30分钟再解开结扎线，恢复血流灌注建立小鼠MIRI模型,假手术(Sham)组除不结扎缝线外其余处理均相同。Evansblue/TTC心脏染色、血清心肌肌钙蛋白T(cTnT)检测和心脏超声评估心功能以验证MIRI模型是否成功。流式细胞术检测Sham组和再灌注后不同时间点(12小时、24小时、72小时)心脏及脾脏中ILCreg细胞在淋巴细胞中的比例。流式细胞术检测健康成年小鼠心脏和脾脏中ILCreg细胞数目。
2.使用Id3flox/floxId2-creERT2小鼠，予腹腔注射他莫昔芬诱导清除ILCreg细胞，作为ILCregKO组；Id2-creERT2小鼠予腹腔注射他莫昔芬作为给药对照组；WT小鼠作为野生型对照组，各组均予缺血30分钟，再灌注24小时构建MIRI模型。Evansblue/TTC染色检测心脏梗死面积，心脏超声评估心功能，电化学发光法检测小鼠血清cTnT水平，免疫组化染色(IHC)检测心肌组织中性粒细胞密度。
3.使用IL-10-GFP报告基因小鼠，从小肠中消化富集固有淋巴细胞(ILCs)，使用白介素2(IL-2)和转化生长因子β1(TGF-β1)体外培养扩增后，流式分选出ILCreg细胞，与原代心肌细胞共培养，使用H2O2诱导心肌细胞凋亡，流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例，实时荧光定量PCR(qPCR )和免疫印迹实验(Western Blot)分别检测心肌细胞Bax、Bcl-2mRNA和蛋白表达。
结果1.健康成年小鼠心脏中ILCreg细胞平均数目为(1.75±0.71)×102，脾脏中ILCreg细胞平均数目为(1.89±0.83)×103。随再灌注时间的延长，心脏中ILCreg细胞的比例于再灌注24小时显著升高(P＜0.001，n=9)，于72小时下降至基础水平，脾脏中ILCreg细胞的比例也于再灌注24小时显著升高(P＜0.0001，n=9)，于72小时下降至基础水平。
2.再灌注24小时，ILCregKO组小鼠的心脏梗死面积、左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)、血清cTnT水平和心肌组织中性粒细胞密度与给药对照组相比均无显著差别(P＞0.05，n=6)。
3.体外条件下，ILCreg细胞减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡，H2O2刺激后，同ILCreg细胞共培养的原代心肌细胞与对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均明显降低(P＜0.05，n=3)。作用机制上，ILCreg细胞可抑制H2O2刺激所致心肌细胞Bax与Bcl-2mRNA表达量比值和蛋白表达量比值的升高(P＜0.05，n=3)。
结论心脏和脾脏中ILCreg细胞在MIRI过程中反应性增加，在体清除ILCreg细胞对MIRI的严重程度没有明显影响，也不影响心肌组织中性粒细胞浸润。体外培养的ILCreg细胞表现出一定的抗心肌细胞凋亡作用，并可能通过调节Bax和Bcl-2的表达而发挥效应。