论文部分内容阅读
第一部分NOA减数分裂阻滞患者精浆游离mRNAs差异表达的筛选与鉴定
【目的】通过比较NOA患者睾丸病理诊断为减数分裂阻滞(meiosis arrest，MA)和非减数分裂阻滞(non-MA)精浆游离mRNAs(cfs-mRNAs)的差异，筛选用于无创性诊断NOA患者MA的cfs-mRNAs。
【方法】(1)依据NOA患者的纳入标准，收集NOA患者睾丸病理结果显示为MA和non-MA患者的精液标本各9例，分离精浆后提取总RNA，用表达谱芯片(Affymetrix HTA2.0 Array)检测，比较以上两组患者cfs-mRNAs的差异；(2)在差异明显cfs-mRNAs中随机筛选8个基因在同批样本中进行相对定量qPCR来验证芯片检测的结果；(3)筛选相对于non-MA患者，在MA患者中表达明显降低，睾丸特异表达且与减数分裂相关的cfs-mRNAs作为候选基因；(4)对筛选到的cfs-mRNAs进行基因主要器官来源筛选：用相对定量qPCR的方法在精液参数正常男性、梗阻性无精子症(OA)和完全性唯支持细胞综合征(SCOS)患者的精浆中进行cfs-mRNAs器官来源的筛选，以保证所筛选的cfs-mRNA来源于睾丸并且由生精细胞分泌，减少其他器官来源的液体的干扰；(5)采用巢式绝对定量qPCR的方法在同类型53例MA和27例non-MA患者中，比较候选cfs-mRNAs的差异，用ROC曲线确定诊断MA的RT-qPCR的切点值。
【结果】通过对MA和non-MA两组cfs-mRNAs的表达谱芯片的比较，我们一共检测了67529个mRNAs，与non-MA组相比，MA组cfs-mRNAs上调175个，下调16258个(差异倍数>2，p<0.05)。利用生物信息学分析手段，揭示了这些下调cfs-mRNAs参与了许多重要的生物学过程，包括细胞增殖和分化，精子的发生和凋亡等。(2)随机挑选的8个cfs-mRNAs，在同批样本中进行RT-qPCR来验证，结果与芯片检测结果趋势相同。(3)按照差异倍数＞1.5倍，p＜0.05的筛选标准，在表达谱芯片的检测结果中筛选差异表达的cfs-mRNAs，并根据GO分析筛选与精子发生、减数分裂相关基因，从中挑选出8个在睾丸中特异性表达基因，即AKAP4，ESX1，FSCN3，KDM3A，BOLL，TCP11，ZMYND15，SPEM1。5个在NCBI数据库中显示在器官中广泛表达，但是睾丸表达量最丰富且前列腺的表达量小于睾丸的1/2，SOHLH2、TDRKH、SETX、MCM8、TUBB4B。此外，TNP1、ODF1、PRM2芯片表达结果的差异倍数均大于1.2，虽然没有统计学意义，但这三个基因分别在圆形精子和精子中表达，有大量文献表明这三个基因在睾丸样本中的表达可以用于NOA病理分类诊断或预测micro-TESE取精结果[36-41]。因此我们也把这三个基因作为候选基因。(4)在精液参数正常男性、OA和SCOS的cfs-mRNAs中相对定量RT-qPCR，比较cfs-mRNAs在三组之间表达的差异。共筛选出8个相对于正常人，在OA以及SCOS中不表达，或者表达下调两倍以上的cfs-mRNAs，作为候选cfs-mRNAs进行后续进一步筛选。(5)建立巢式RT-qPCR的方法在同类型的样本，MA和NON-MA的病人精浆中进行cfs-mRNA进一步比较，以候选基因相对表达量=候选基因拷贝数/ACTIN拷贝数的方式，计算候选基因表达量。比较MA组和non-MA组的表达差异。筛选出BOLL(p<0.001)和TNP1(p<0.01)相对于non-MA患者，MA患者的精浆表达量明显降低且具有统计学意义。(6)利用ROC曲线分析，BOLL诊断NOA患者减数分裂的切点值为BOLL的绝对表达量≤367.0595(copies/μL)可诊断为MA，曲线下面积为0.819，p<0.001，灵敏度为84.2%，特异度为78.3%。TNP1诊断NOA患者减数分裂的切点值为TNP1的绝对表达量≤62.3412(copies/μL)可诊断为MA，曲线下面积为0.725，p<0.05，灵敏度为59.6%，特异度为82.6%。
【结论】我们的实验结果表明多种cfs-mRNAs在MA和non-MA的NOA患者差异表达。通过基因主要器官来源的筛选实验，确保了筛选出的cfs-mRNAs来源于睾丸并且由生精细胞表达。巢式RT-qPCR扩大样本比较后，筛选出了BOLL、TNP1可以用来诊断NOA减数分裂阻滞。
第二部分预测NOA患者micro-TESE取精结局的cfs-mRNAs筛选
【目的】利用第一部分建立的巢式RT-qPCR的方法，分析候选基因在预测micro-TESE取精成功可能性的作用。对同一个患者的睾丸组织和精浆基因表达量进行关联性分析。对手术micro-TESE取精成功与失败，BOLL预测micro-TESE取精成功与失败的患者的临床特征分析。
【方法】(1)收集80例做过micro-TESE手术的病人的精液样本，离心分离精浆，提取其中的总RNA，按照第一部分建立的巢式RT-qPCR的方法，比较第一部分中筛选通过基因来源验证的8个候选基因(AKAP4、 BOLL、 TCP11、 TNP1、PRM2、ODF1、MCM8、SETX)在micro-TESE取精成功和取精失败的表达差异。(2)在同时有睾丸组织和精液的病人中，提取组织和cfs-mRNA采用相对定量RT-qPCR的方法，对候选基因在睾丸组织和精浆中表达的关联性分析。(3)收集患者年龄、精液量、FSH、LH、T、睾丸体积，采用非配对t检验分析这些数据在micro-TESE取精成功与失败，BOLL预测micro-TESE取精成功与失败、MCM8预测micro-TESE取精成功与失败的这些基本临床特征中的统计学差异。
【结果】(1)我们共收集了做过micro-TESE的80例标本，在这些样本中我们进一步筛选在第一部分中筛选通过cfs-mRNAs主要器官来源筛选的8个候选基因(AKAP4、BOLL、TCP11、TNP1、PRM2、ODF1、MCM8、SETX)，其中BOLL和MCM8在micro-TESE取精成功的精浆样本中的表达量明显低于micro-TESE取精失败的患者，差异具有显著性意义(p<0.05)。(2)NOA患者的睾丸组织与精浆组织BOLLmRNA表达呈显明显的正相关(r=0.9389，p<0.01)。(3)手术micro-TESE取精成功和失败病人的精液体积(p<0.01)具有显著差异，年龄、激素水平以及睾丸体积没有显著差异。BOLL预测micro-TESE取精成功和失败的病人年龄、精液体积、激素水平以及睾丸体积同样没有显著差异。MCM8预测micro-TESE取精成功和失败的病人年龄、激素水平同样没有显著差异，MCM8预测micro-TESE取精成功的患者精液体积明显小于取精失败的(p<0.05)患者，MCM8预测micro-TESE取精成功的患者睾丸体积明显小于取精失败的(p<0.05)患者。
【结论】(1)BOLL和MCM8可以预测micro-TESE取精成功可能性，BOLL具有更好的临床应用价值。(2)睾丸组织和精浆中的BOLLmRNA表达水平呈正相关。睾丸组织精浆中的BOLLmRNA表达量可以很好的反应睾丸中BOLLmRNA的表达。(3)MCM8预测micro-TESE取精成功的患者睾丸体积明显大于micro-TESE取精失败的患者(p＜0.05)，MCM8预测取精micro-TESE取精结局方法可能会有更高的准确性。患者的激素水平精液体积和年龄可能对micro-TESE取精结局没有预测价值。
【目的】通过比较NOA患者睾丸病理诊断为减数分裂阻滞(meiosis arrest，MA)和非减数分裂阻滞(non-MA)精浆游离mRNAs(cfs-mRNAs)的差异，筛选用于无创性诊断NOA患者MA的cfs-mRNAs。
【方法】(1)依据NOA患者的纳入标准，收集NOA患者睾丸病理结果显示为MA和non-MA患者的精液标本各9例，分离精浆后提取总RNA，用表达谱芯片(Affymetrix HTA2.0 Array)检测，比较以上两组患者cfs-mRNAs的差异；(2)在差异明显cfs-mRNAs中随机筛选8个基因在同批样本中进行相对定量qPCR来验证芯片检测的结果；(3)筛选相对于non-MA患者，在MA患者中表达明显降低，睾丸特异表达且与减数分裂相关的cfs-mRNAs作为候选基因；(4)对筛选到的cfs-mRNAs进行基因主要器官来源筛选：用相对定量qPCR的方法在精液参数正常男性、梗阻性无精子症(OA)和完全性唯支持细胞综合征(SCOS)患者的精浆中进行cfs-mRNAs器官来源的筛选，以保证所筛选的cfs-mRNA来源于睾丸并且由生精细胞分泌，减少其他器官来源的液体的干扰；(5)采用巢式绝对定量qPCR的方法在同类型53例MA和27例non-MA患者中，比较候选cfs-mRNAs的差异，用ROC曲线确定诊断MA的RT-qPCR的切点值。
【结果】通过对MA和non-MA两组cfs-mRNAs的表达谱芯片的比较，我们一共检测了67529个mRNAs，与non-MA组相比，MA组cfs-mRNAs上调175个，下调16258个(差异倍数>2，p<0.05)。利用生物信息学分析手段，揭示了这些下调cfs-mRNAs参与了许多重要的生物学过程，包括细胞增殖和分化，精子的发生和凋亡等。(2)随机挑选的8个cfs-mRNAs，在同批样本中进行RT-qPCR来验证，结果与芯片检测结果趋势相同。(3)按照差异倍数＞1.5倍，p＜0.05的筛选标准，在表达谱芯片的检测结果中筛选差异表达的cfs-mRNAs，并根据GO分析筛选与精子发生、减数分裂相关基因，从中挑选出8个在睾丸中特异性表达基因，即AKAP4，ESX1，FSCN3，KDM3A，BOLL，TCP11，ZMYND15，SPEM1。5个在NCBI数据库中显示在器官中广泛表达，但是睾丸表达量最丰富且前列腺的表达量小于睾丸的1/2，SOHLH2、TDRKH、SETX、MCM8、TUBB4B。此外，TNP1、ODF1、PRM2芯片表达结果的差异倍数均大于1.2，虽然没有统计学意义，但这三个基因分别在圆形精子和精子中表达，有大量文献表明这三个基因在睾丸样本中的表达可以用于NOA病理分类诊断或预测micro-TESE取精结果[36-41]。因此我们也把这三个基因作为候选基因。(4)在精液参数正常男性、OA和SCOS的cfs-mRNAs中相对定量RT-qPCR，比较cfs-mRNAs在三组之间表达的差异。共筛选出8个相对于正常人，在OA以及SCOS中不表达，或者表达下调两倍以上的cfs-mRNAs，作为候选cfs-mRNAs进行后续进一步筛选。(5)建立巢式RT-qPCR的方法在同类型的样本，MA和NON-MA的病人精浆中进行cfs-mRNA进一步比较，以候选基因相对表达量=候选基因拷贝数/ACTIN拷贝数的方式，计算候选基因表达量。比较MA组和non-MA组的表达差异。筛选出BOLL(p<0.001)和TNP1(p<0.01)相对于non-MA患者，MA患者的精浆表达量明显降低且具有统计学意义。(6)利用ROC曲线分析，BOLL诊断NOA患者减数分裂的切点值为BOLL的绝对表达量≤367.0595(copies/μL)可诊断为MA，曲线下面积为0.819，p<0.001，灵敏度为84.2%，特异度为78.3%。TNP1诊断NOA患者减数分裂的切点值为TNP1的绝对表达量≤62.3412(copies/μL)可诊断为MA，曲线下面积为0.725，p<0.05，灵敏度为59.6%，特异度为82.6%。
【结论】我们的实验结果表明多种cfs-mRNAs在MA和non-MA的NOA患者差异表达。通过基因主要器官来源的筛选实验，确保了筛选出的cfs-mRNAs来源于睾丸并且由生精细胞表达。巢式RT-qPCR扩大样本比较后，筛选出了BOLL、TNP1可以用来诊断NOA减数分裂阻滞。
第二部分预测NOA患者micro-TESE取精结局的cfs-mRNAs筛选
【目的】利用第一部分建立的巢式RT-qPCR的方法，分析候选基因在预测micro-TESE取精成功可能性的作用。对同一个患者的睾丸组织和精浆基因表达量进行关联性分析。对手术micro-TESE取精成功与失败，BOLL预测micro-TESE取精成功与失败的患者的临床特征分析。
【方法】(1)收集80例做过micro-TESE手术的病人的精液样本，离心分离精浆，提取其中的总RNA，按照第一部分建立的巢式RT-qPCR的方法，比较第一部分中筛选通过基因来源验证的8个候选基因(AKAP4、 BOLL、 TCP11、 TNP1、PRM2、ODF1、MCM8、SETX)在micro-TESE取精成功和取精失败的表达差异。(2)在同时有睾丸组织和精液的病人中，提取组织和cfs-mRNA采用相对定量RT-qPCR的方法，对候选基因在睾丸组织和精浆中表达的关联性分析。(3)收集患者年龄、精液量、FSH、LH、T、睾丸体积，采用非配对t检验分析这些数据在micro-TESE取精成功与失败，BOLL预测micro-TESE取精成功与失败、MCM8预测micro-TESE取精成功与失败的这些基本临床特征中的统计学差异。
【结果】(1)我们共收集了做过micro-TESE的80例标本，在这些样本中我们进一步筛选在第一部分中筛选通过cfs-mRNAs主要器官来源筛选的8个候选基因(AKAP4、BOLL、TCP11、TNP1、PRM2、ODF1、MCM8、SETX)，其中BOLL和MCM8在micro-TESE取精成功的精浆样本中的表达量明显低于micro-TESE取精失败的患者，差异具有显著性意义(p<0.05)。(2)NOA患者的睾丸组织与精浆组织BOLLmRNA表达呈显明显的正相关(r=0.9389，p<0.01)。(3)手术micro-TESE取精成功和失败病人的精液体积(p<0.01)具有显著差异，年龄、激素水平以及睾丸体积没有显著差异。BOLL预测micro-TESE取精成功和失败的病人年龄、精液体积、激素水平以及睾丸体积同样没有显著差异。MCM8预测micro-TESE取精成功和失败的病人年龄、激素水平同样没有显著差异，MCM8预测micro-TESE取精成功的患者精液体积明显小于取精失败的(p<0.05)患者，MCM8预测micro-TESE取精成功的患者睾丸体积明显小于取精失败的(p<0.05)患者。
【结论】(1)BOLL和MCM8可以预测micro-TESE取精成功可能性，BOLL具有更好的临床应用价值。(2)睾丸组织和精浆中的BOLLmRNA表达水平呈正相关。睾丸组织精浆中的BOLLmRNA表达量可以很好的反应睾丸中BOLLmRNA的表达。(3)MCM8预测micro-TESE取精成功的患者睾丸体积明显大于micro-TESE取精失败的患者(p＜0.05)，MCM8预测取精micro-TESE取精结局方法可能会有更高的准确性。患者的激素水平精液体积和年龄可能对micro-TESE取精结局没有预测价值。