论文部分内容阅读
耐热对硝基苯酚磷酸酶（Thermo p-nitrophenylphosphatase，Bs-TpNPPase）来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilius)，是一种具有Mg2+依赖性的专一性碱性磷酸酶。序列分析指出该酶是HAD超家族成员，属于IIA亚家族。其作用底物为对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenylphosphate，pNPP)。细菌和哺乳动物的对硝基苯酚磷酸酶能分解对硝基苯磷酸盐，生成黄色产物对硝基酚，因而被广泛应用于核酸标记。 本论文以Bs-TpNPPase为主要研究材料，利用晶体X-衍射手段测定其三维结构，以此为基础利用定向进化技术得到大量热稳定性提高的突变体。通过综合分析Bs-TpNPPase的一级结构、高级结构以及突变体的特征，试阐明Bs-TpNPPase催化机制与热稳定性的分子机制。热稳定性提高的突变体可为未来Bs-TpNPPase在核酸标记中的应用打下一定基础。通过蛋白的表达纯化，对Bs-TpNPPase的酶学性质，蛋白质晶体结构和耐热机制进行了研究，并通过其完整的蛋白质晶体结构，从空间结构的角度探寻该蛋白质的热稳定性机制。本论文获得了以下一些主要结果和结论: 1.表达和纯化Bs-TpNPPase。通过Ni-NTA亲和层析和Sephadex G-75分子筛层析两步纯化，获得了高纯度的重组Bs-TpNPPase。理化性质测定的结果显示，Bs-TpNPPase的最适反应温度为55℃，Tm=55℃，Km=1.7429mM，kat=1.04×104 s-1，Kcat/Km=5960mM-1 s-1。 2.将纯化好的Bs-TpNPPase，通过气相悬滴扩散法筛选并优化获得了高质量的晶体，经X-射线衍射蛋白质晶体收集得到了分辨率为1.50(A)的衍射数据。晶体空间群同为P212121，单个晶胞参数分别为a=38.802，b=83.268，c=175.799，α=β=γ=90°。分子置换法确定了相位，并最终成功解析了Bs-TpNPPase的晶体结构。晶体结构中的一个异构独立对称单位中有两个单体分子，每个单体分子由结合比较紧密并有相互作用的两个结构域（cap结构域和core结构域）组成，两个结构域的一级结构有交叉;晶体结构中有9个标准α螺旋，16个β折叠和24个β转角。结构显示Bs-TpNPPase与经典的IIA家族成员相似，结合活性位点关键氨基酸突变实验的结果，表明Bs-TpNPPase具有经典的HAD超家族催化机制。 3.从PDB库中选取7个已经获得晶体结构并与Bs-TpNPPase有一定同源性和相近氨基酸数量的HAD超家族成员。其中Afp、Php、Tmp来源于嗜热菌，Bsp和Ecp来自常温菌，Mmp来源于小鼠，Hup来源于人。对比分析这8个不同来源蛋白质的一级结构和三级结构，发现Bs-TpNPPase的耐热机制很可能是通过增加疏水作用和芳香族氨基酸的相互作用，扩大K=3k-clique疏水作用簇网络，加强cap结构域的稳定性，进而提高整体蛋白质的热稳定性。 4.运用Error-PCR技术对Bs-TpNPPase进行热稳性的定向进化，对筛选出的热稳定性提高的突变体进行表达纯化和一般酶学性质的测定。通过3轮PCR，获得了11个热稳定性提高的突变体，其中7个为单氨基酸突变K30R、A75V、E95V、A150V、F157L、H170Y、K175N。4个为双氨基酸突变N86S/A150V、E95D/A150V、A150V/T177I、A150V/F157L。从这些突变体中可以观察到，A150V对于提高Bs-TpNPPase的热稳定性起到了关键作用，A150V的Tm值提高了8℃，酶与底物的亲和度提高了3倍;F157L使的Tm值提高了4℃，也使酶活性提高了6.8倍;而A150V/F157L的双突变体，使蛋白获得了更高的热稳定性，Tm值提高了12℃，与底物亲和力提高2倍。 5.根据Bs-TpNPPase的晶体结构，发现热稳定性提高的突变体中仅K30R的突变氨基酸位于core结构域，其他突变体突变氨基酸均位于cap结构域，且K30R的Tm升高幅度在11个突变体中最小，提示Bs-TpNPPase的两个结构域中cap结构域的稳定性较差。利用SWISS-MODEL和PIC webserver在线软件对突变体进行空间结构模拟并计算模拟结构中疏水作用、氢键、盐桥等相互作用。发现位于cap结构域的突变体是通过加强蛋白质分子表面的疏水作用及增加K=3k-clique疏水作用簇提升蛋白质的热稳定性，这与Bs-TpNPPase在自然进化中提升热稳定性所采取的策略相同。 6.为确定模拟结构的可靠性，表达纯化Tm提升幅度最大的单突变体A150V与Tm提升幅度最大的双突变体A150V/F157L。通过气相悬滴扩散法获得了晶体，收集衍射数据并进行结构解析和结构对比。比较发现Bs-TpNPPase、A150V和A150V/F157L的晶体结构与模拟结构在整体上非常接近。对A150V和A150V/F157L晶体结构分析得到的热稳定性提高的机制与模拟结构中分析得到热稳定性提高的机制基本一致。但晶体结构与模拟结构在突变氨基酸的空间构象上仍有一定偏差。突变体A150V模拟结构中150V的侧链空间构象与晶体结构中的150V侧链空间构象的差异导致晶体结构中突变氨基酸150V与152P，157F之间形成了K=3k-clique疏水作用簇。突变体A150V/F157L晶体结构相比模拟结构中形成的K=3k-clique疏水作用簇的空间构象更紧凑。