论文部分内容阅读
喹乙醇是一种喹噁啉-N1,N4-二氧化物,作为动物生长促进剂而被广泛使用,曾被认为是一种相对安全的抗生素。随着该药物在养殖业中的长期使用,其耐药问题也逐步被认识。2003年从丹麦猪粪中分离出一株大肠杆菌,含有介导喹乙醇耐药的接合型质粒pOLA52。次年研究发现质粒pOLA52携带外排泵基因oqxAB,不仅介导喹乙醇耐药,还能降低细菌对氯霉素、喹诺酮类药物的敏感性。因此,2009年oqxAB基因也被归为一种质粒介导的喹诺酮类药物耐药(Plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)基因。目前关于oqxAB基因的流行病学和耐药机理的报道较少,研究数据相对匮乏。为了解喹乙醇耐药基因oqxAB在我国大肠杆菌分离株中的流行特性及其基因定位。本研究通过测定分离株对喹噁啉类药物(乙酰甲喹和喹乙醇)的最低抑菌浓度,设定耐药临界值,分析基因型和耐药表型的相关性,了解不同来源菌株的耐药情况；通过质粒接合试验获得oqxAB阳性接合子,对供体菌、受体菌及接合子进行喹嗯啉类(乙酰甲喹、喹乙醇)、p-内酰胺类(氨苄西林)、氨基糖苷类(庆大霉素)、喹诺酮类(萘啶酸)、苯丙醇类(氯霉素)、四环素类(四环素)药物的敏感性试验,测定oqxAB对各种药物MIC的影响及与其共转移的耐药基因；调查近两年oqxAB基因在我国大肠杆菌中的流行和分布情况；定位oqxAB基因在大肠杆菌染色体还是质粒上；测定oqxAB基因及其两翼序列,了解oqxAB基因的结构特征。1.不同源大肠杆菌分离株耐药基因oqxAB的流行特性通过测定1017株大肠杆菌对乙酰甲喹和喹乙醇的MIC值,对乙酰甲喹和喹乙醇MIC≥128μg/mL的菌株都为oqxAB基因阳性,分离株对乙酰甲喹、喹乙醇MIC值为64μg/mL时,oqxAB基因阳性菌株比例(95.4%和76.8%)显著高于阴性菌株(4.6%和23.2%)。oqxAB基因阳性菌株对乙酰甲喹、喹乙醇MIC50(64μg/mL,64μg/mL)高于oqxAB阴性菌株对乙酰甲喹、喹乙醇MIC50(4μg/mL,16μg/mL)。当MIC≥64μg/mL的情况下,oqxAB基因阳性菌株数显著多于阴性菌株数。设定乙酰甲喹和喹乙醇MIC≥64μg/mL为耐药,MIC=32μg/mL为中介,MIC≤16μg/mL为敏感。在1993年至2010年1017株不同源大肠杆菌中,92.4%和99.1%的oqxAB基因阳性菌株分别对乙酰甲喹和喹乙醇耐药或者中介。99.4%和95.2%的oqxAB基因阴性菌株分别对乙酰甲喹和喹乙醇敏感或者中介。基因型与耐药表型基本一致。在1017株大肠杆菌中,猪源分离株对乙酰甲喹和喹乙醇耐药率最高(33.3%和41.5%),其次为鸡源和环境源分离株,人源株(2.6%,8/306)也出现了一定程度耐药。肠道内分离株对乙酰甲喹和喹乙醇的耐药率(16.8%和23.2%)高于肠道外分离株(11.2%和13.9%),而环境源分离株对喹乙醇的耐药率最高(36.4%)。对210株oqxAB基因阳性菌株进行质粒接合试验,共获得35株oqxAB阳性接合子。33株(94.3%)接合子对乙酰甲喹和喹乙醇耐药,其余2株MIC都为中介值32μg/mL;分别有68.6%(24/35)、85.7%(30/35)、74.3%(26/35)、65.7%(23/35)和71.4%(25/35)的氨苄西林、四环素、氯霉素、萘啶酸和庆大霉素耐药基因与oqxAB基因共同转移。oqxAB基因可以介导菌株对乙酰甲喹和喹乙醇的耐药性,不同程度降低细菌对氯霉素和萘啶酸的敏感性,与受体菌相比,接合子MIC值分别升高4-256和2-128倍。在2011-2012年分离自不同来源的150株大肠杆菌中,PMQR基因的阳性率为39.3%(59/150),其中oqxAB基因的阳性率为35.3%(53/150),显著高于qnrB (0.7%)、qnrS(7.3%)和qepA(1.3%)。猪源分离株中oqxAB基因阳性率(63.6%,7/11)高于鸡源分离株(40%,48/120),并首次在鸽源菌株中检测到oqxAB基因。通过分析本实验室前期研究结果,在1993-2010年1022株大肠杆菌中,每三年的检出率分别为12.9%、14.3%、19.6%、41.6%、20.5%和14.1%,平均阳性率为20.2%,低于2011-2012年的阳性率35.3%；oqxAB基因检出率最高的年份为2002-2004年(41.6%)。2.不同源大肠杆菌分离株耐药基因oqxAB的基因定位通过S1-PFGE及Southern杂交定位35株接合子及其供体菌、26株接合未成功分离株oqxAB基因位于染色体还是质粒上。35株接合子及其供体菌携带oqxAB基因质粒的大小为40-360kb,其中34株供体菌oqxAB基因仅位于质粒上,另1株供体菌同时在染色体和质粒上存在oqxAB基因,且同时位于两个大小不同的质粒(310kb、350kb)。26株接合未成功的野生菌株中,25株携带oqxAB基因质粒的大小为43-310kb,另1株oqxAB仅位于染色体。大肠杆菌中oqxAB基因主要位于质粒上。通过对两株大肠杆菌oqxAB及其两翼序列进行测序,与大肠杆菌质粒pOLA52序列同源性为100%, oqxAB两翼为IS26,与肺炎克雷伯杆菌MGH78578、NTUH-K2044、342染色体序列同源性为96%-99%。在GenBank登陆的17个大肠杆菌oqxAB序列(登录号：JX412478、JX469117、JX442218、JX429863、JX294475、JF912901、HQ674771、HQ674770、 AB601773、AB601772、AB601771、AB601770、GQ497565、GQ120634、EU370913、JF912902、 GU477622)中,其序列同源性为99%-100%,其中4个oqxAB序列(登录号：JX469117、 JX429863、EU370913、GU477622)测定两翼序列都为IS26。通过序列分析可知,oqxAB及其两翼IS26序列主要构成了一个复合转座子Tn6010,且该复合转座子可能是从肺炎克雷伯杆菌染色体上获得的。