论文部分内容阅读
背景肝细胞肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，占全世界恶性肿瘤死亡原因的第三位。肝移植作为有效的根治性手段，被各肝病中心所推崇。但鉴于肝癌尤其晚期肝癌术后易复发，且肝移植手术费用大、风险高及肝源较紧张，术前病例的选择变得越来越重要。普遍认为肿瘤大小、数目、血管侵犯、淋巴结转移等与术后复发率相关，但目前标准对于肝癌肝移植术受体选择尚不够个体化，能否从细胞分子角度来完善肝移植术前肝癌受体的选择，是本实验探索性研究的目的。肝癌的发生、生长、迁徙、侵袭等生物学机制十分复杂，癌基因的激活及抑癌基因的失活导致癌的发生、发展。在这个过程中，多个基因产物参与其中，如：细胞粘附因子、基质分解酶、细胞增殖调控因子、血管新生因子等等，其中，E-cadherin介导的细胞粘附和细胞极性形成对抑制上皮性肿瘤的侵袭转移、去分化作用，和由E-cadherin及与其胞内段相连接的β-catenin形成的cadherin／catenin复合体对肿瘤侵袭转移的影响及其作用机制，日益引起重视。Ki-67则是一种存在于增殖细胞核基质内与细胞有丝分裂、增殖相关的核蛋白，可反映肿瘤细胞的增殖活性。本实验选择这三个生物学标记物，试探性研究他们在肝癌肝移植预后方面的价值。材料和方法1材料2002年4月至2005年11月选择肝癌移植手术病例共50例，其中：男性48例，女性2例，年龄19-64岁、平均47岁；合并乙型病毒性肝炎有44例（占88.0％），合并肝硬化有48例（占96.0％），肿瘤直径大于5cm有34例（占68.0％），肿瘤数目在2个或以上的有33例（占66.0％），术前血清甲胎蛋白（AFP）高于400μg／L的有27例（占54.0％），TNM分期为：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期42例。所有病例术后均经病理确诊“肝细胞肝癌”，最终根本死因均由于肿瘤复发，且术后均未经抗肿瘤治疗。所有存活病例术后至少随访12个月。2方法2．1试剂：一抗分别为E-cadherin、β-catenin、Ki-67的单克隆抗体，均稀释成1：50，采用PowerVisionTM二步法试剂盒检测（以上均购自北京中衫金桥生物技术有限公司）。2．2免疫组化步骤：采用50例肝癌的石蜡标本，4μm厚度切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；3％过氧化氢孵育10min后，在pH6.0的枸橼酸缓冲液中进行抗原热修复，采用电炉煮沸法，温度控制在95℃左右、15min；自然冷却后，滴加Ⅰ抗孵育4℃过夜；第2天复温后滴加Ⅱ抗孵育25min；最后DAB-显色、苏木素复染、脱水、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。2．3组化结果判定：以比较肝癌细胞与周围非癌肝细胞的胞膜染色深浅，来判断E-cadherin、β-catenin的肿瘤细胞膜表达强弱；以β-catenin肿瘤细胞的核染色有无来判断核表达的阳性阴性结果（不考虑核阳性的百分比）；以癌细胞中Ki-67核染色的百分率高低（限定10％为界），来判断其增殖指数的高低。每张切片约浏览10个高倍镜视野、数1000个细胞。2．4移植术后复发判定：以检测术后血清AFP和影像学检查（CT、B超等）来判断有无复发，难以鉴别的采用穿刺活检，病理证实。2．5统计学分析：应用SPSS 13.0软件进行统计学处理。Kaplan-Meier法进行单变量分析，Log-rank检验差异：Cox回归应用于多变量分析。结果1临床指标在单变量分析中，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期（P=0.033，0.028）、门静脉癌栓（P=0.014，0.045），均与预后（高复发，低生存率）有统计学意义；术前血清AFP仅在多变量分析中与复发有统计学意义（OR=2.552，P=0.032）。2生物学标记物单变量分析示：癌细胞膜E-cadherin低表达病例中，22例（88.0％）复发、18例（72.0％）死亡，和高复发、低生存率的相关P值分别为0.002与0.007；癌细胞核β-catenin阳性病例中，6例（85.7％）复发并死亡，和复发、生存的相关P值分别为0.016与0.010：癌细胞核Ki-67高增殖指数病例中，12例（92.3％）复发、10例（76.9％）死亡，和复发、生存的相关P值分别为0.000与0.006。多变量分析结果示，E-cadherin低表达（OS=4.586，P=0.003）、β-catenin核聚（OS=5.796，P=0.002）、Ki-67高增殖指数（OS=3.990，P=0.003）均有显著统计学意义。另外，统计结果未显示胞膜β-catenin表达与复发、生存相关。结论1．从本实验小样本研究看，肝癌细胞膜上E-cadherin蛋白的表达情况、肝癌细胞核β-catenin有无聚集以及核Ki-67增殖指数对于预测肝细胞肝癌移植术后肿瘤复发、生存时间是有价值的。2．肝癌患者移植术前做肿瘤穿刺取材及免疫组化检测，临床实践上具可行性，尤其对于β-catenin核聚集及Ki-67增殖指数，组化结果判断相对客观。3．需进一步确定其预后价值，还需大样本研究。