研究背景肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，发病率仅次于膀胱癌而居第二位，且呈逐年上升之势。50%以上肾癌早期无特异性症状，偶然发现时往往已进入中晚期，且大约1/3的患者已有转移,而转移性肾癌预后不佳。目前肾癌的治疗以手术为主，但早期诊断率的低下，放疗和化疗的不敏感，加之免疫治疗的远期效果较局限，使得肾癌的整体治疗效果仍然欠佳。为了提高肾癌的早期诊断率，改善肾癌的疗效，非常有必要加强肾癌的基础研究，以期阐明其发生发展机制。Exosomes是真核细胞多泡体与细胞膜融合后所释放出的30-100nm的膜性小囊泡，广泛分布于细胞周围微环境，其成分复杂，富含多种蛋白。研究表明，exoxomes与肿瘤的免疫调节紧密相关。本课题组在前期工作中首次成功提取了肾癌细胞来源的exosomes，发现其富含肾癌特异性抗原G250、热休克蛋白70(HSP70)和细胞间粘附分子(ICAM-1)等反映肾癌生物学信息的蛋白，还能诱导单核细胞分化为PD-L1+髓源性抑制细胞。因此，肾癌细胞来源的exosomes可能影响肾癌的发生发展及免疫效应。既然肾癌细胞来源的exosomes广泛存在于肿瘤细胞周围，那么它对肾癌细胞的生长和增殖、凋亡及侵袭迁移等生物学行为有无直接影响，如果有影响，是促进还是抑制效应，目前未见相关报道；对肿瘤微环境的免疫调节，究竟是增强免疫还是诱导免疫逃逸，或者是在什么情况下增强免疫效应，在什么情况下诱导免疫逃逸，以及其发生机制等一系列问题也还不清楚。因此，研究肾癌细胞来源的exosomes对肾癌细胞自身生物学行为的影响和对肿瘤微环境的免疫调节作用，可分别从exosomes对肿瘤的直接和间接作用，及exosomes对机体局部和整体的影响，多角度全面地探明肾癌细胞来源的exosomes对肾癌恶性演进的影响，通过该研究有望揭示肾癌的恶性发展及免疫逃逸的机制，并为肾癌的免疫治疗提供新思路。目的本课题以肾癌786-0细胞为实验对象，提取肾癌细胞来源的exosomes，研究肾癌786-0细胞来源的exosomes对肾癌细胞自身增殖_凋亡、侵袭迁移，以及对Jurkat T细胞凋亡的影响，并初步探讨其机制，以期揭示肾癌细胞分泌的exosomes在肾癌的恶性演进中的作用，为肾癌免疫治疗提供新思路。方法1、分别采用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法、ExoQuick试剂盒提取肾癌786-0细胞分泌的exosomes。2、使用透射电子显微镜观察exosomes的形态。3、采用Bradford法对exosomes的总蛋白进行定量分析。4、CCK-8法检测exosomes对肾癌细胞、Jurkat T细胞生长增殖的影响。5、Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡变化。6、瑞氏-姬姆萨染色后光镜下观察Jurkat T细胞形态的变化。7、ELISA法检测Jurkat T细胞分泌功能。8、可溶性Fas阻断实验检测exosomes对Jurkat T细胞凋亡率的影响。9、RT-PCR法检测基因表达的变化。10、Western blotting检测蛋白表达水平的变化。11、统计学方法:采用SPSS17.0软件进行t检验分析。结果1、分别采用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法、ExoQuick试剂盒成功提取肾癌786-0细胞培养上清液来源的exosomes，两种方法获取的exosomes形态相似，蛋白总量相当，特征性蛋白成分也相同。透射电镜下观察到exosomes均具有特征性的脂质双层膜盘状结构，直径约30-l00nm。提取的蛋白浓度均在1500～2000μg/mL之间。Western blotting分析显示，两种方法提取的exosomes蛋白成分主要分布于35～66KD，exosomes表面均富含肾癌特异性抗原G250以及HSP90、CD63、TSG101等分子。但实际运用中，两种提取方法各有优劣。2、肾癌786-0细胞来源的exosomes能促进786-0细胞和ACHN细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性。200μg/mL和400μg/mL的exosomes处理786-0细胞24h，细胞的增殖率分别是对照组的124.09%和141.67%；处理72h后，细胞的增殖率分别是对照组的169.97%和174.4%。200μg/mL和400μg/mL的exosomes处理ACHN细胞24h，细胞的增殖率分别是对照组的126.36%和140.73%；处理72h，细胞的增殖率分别是对照组的167.34%和177.11%。肾癌786-0细胞来源的exosomes可抑制786-0和ACHN细胞凋亡，呈剂量和时间依赖性。10μg/mL exosomes作用786-0细胞24h,凋亡率为（3.76±0.12）%，作用时间延长至72h时,凋亡率为（3.37±0.20）%；400μg/mL exosomes作用24h,凋亡率为（0.94±0.06）%，作用至72h时,凋亡率仅（0.37±0.05）%。10μg/mL exosomes作用ACHN细胞24h,凋亡率为（3.83±0.10）%，作用时间延长至72h时,凋亡率为（3.55±0.23）%；400μg/mL exosomes作用24h，凋亡率为（0.95±0.04）%，作用时间延长到72h时,凋亡率仅（0.38±0.03）%。3、肾癌786-0细胞来源的exosomes促进自身细胞侵袭迁移。侵袭实验中，100μg/mL exosomes处理786-0细胞72h后，786-0细胞穿过Matrigel成胶Transwell小室基底膜的侵袭细胞数量为（147.5±7.87）；400μg/mL exosomes处理72h后，侵袭细胞数量为（270.33±8.48）。迁移实验中，100μg/mL exosomes处理786-0细胞72h后，实验组的跨膜迁移细胞数量为（168.1±5.56），400μg/mL exosomes处理72h后，迁移细胞数量增加为（293.67±7.89）。4、RT-PCR法检测不同浓度的exosomes（100、400μg/mL）作用于肾癌786-0细胞24h后cyclinD1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表达。结果显示，与对照组相比，cyclinD1、Bcl-2mRNA表达增加，Bax mRNA表达减少，呈剂量依赖性。但caspase-3mRNA表达无明显变化。采用Western blotting分析相应蛋白的表达时发现，与对照组比较，cyclinD1、Bcl-2蛋白表达随exosomes浓度的增加而逐渐上调，而Bax、caspase-3蛋白表达随exosomes浓度的增加而逐渐减少。同时检测p-Akt和p-ERK1/2蛋白的表达水平，结果提示exosomes以剂量依赖方式上调p-Akt和p-ERK1/2的表达。细胞侵袭迁移中，采用Westernblotting分析MMP-2、MT1-MMP、NF-κB蛋白表达的变化。发现与对照组相比，MMP-2、MT1-MMP、NF-κB蛋白的表达量均随exosomes浓度的升高而增加。5、肾癌786-0细胞来源的exosomes可抑制Jurkat T细胞生长，10μg/mL exosomes作用于Jurkat T细胞24h，生长抑制率为（19.64±0.92）%，72h为（36.24±1.12）%；400μg/mL exosomes作用24h，生长抑制率为（55.96±1.35）%，72h为（76.51±1.37）%。Exosomes可诱导Jurkat T细胞凋亡，10μg/mL exosomes作用于Jurkat T细胞8h，凋亡率为（7.31±1.32）%，24h为（20.19±1.47）%；400μg/mL exosomes作用8h，凋亡率为（27.28±1.29）%，24h为（41.72±0.88）%。同时采用瑞氏-姬姆萨染色检测Jurkat T细胞形态学的变化，发现Jurkat T细胞的凋亡细胞体积逐渐缩小，细胞质逐渐浓缩，细胞核裂解,直至成碎块，产生凋亡小体。6、Exosomes明显抑制Jurkat T细胞IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10的分泌水平。采用ELISA法检测400μg/mL exosomes作用于Jurkat T细胞8h后分泌细胞因子的功能明显减退，IL-2浓度降为(59.2±14.6)、IFN-γ降为(33.1±4.55)、IL-6降为(62.8±16.1)、IL-10降为(33.7±14.3)。7、FasL蛋白在exosomes上高表达,采用可溶性Fas阻断实验检测Jurkat T细胞凋亡率的变化,发现Jurkat T细胞8、16、24h的凋亡率明显降低，几乎全部逆转了exosomes对Jurkat T细胞凋亡的诱导作用。8、不同浓度的肾癌细胞来源的exosomes作用Jurkat T细胞24h后，发现裂解的caspase-3、caspase-8、 caspase-9片段呈剂量依赖方式表达上调；同时Bax蛋白表达上调， Bcl-2蛋白的表达下调。结论1、超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法、ExoQuick exosomes提取法提纯exosomes方法可行可靠，但各有优劣。肾癌786-0细胞来源的exosomes为纳米级的膜性小囊泡，含有其来源细胞的重要信息，表达肾癌特异性抗原G250以及HSP90、CD63、TSG101等分子。2、肾癌786-0细胞来源的exosomes能促进肾癌786-0和ACHN细胞增殖，同时抑制细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性；exosomes还能够明显促进自身细胞的侵袭迁移，从而直接地促进肾癌细胞恶性发展。3、Cyclin D1分子表达的上调，caspase-3蛋白表达的下调，Bax/Bcl-2比值下降，以及Akt和ERK信号通路的激活，可能是exosomes促增殖抑凋亡的分子机制。Exosomes可能通过上调NF-κB的表达，激活MMPs，降解细胞外基质从而促进肾癌细胞侵袭迁移。4、肾癌细胞来源的exosomes可以剂量和时间依赖的方式诱导Jurkat T淋巴细胞凋亡，抑制其生长。提示exosomes可能下调机体免疫能力，间接地促进肾癌细胞恶性发展。5、Exosomes明显抑制Jurkat T细胞IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10的分泌水平。6、可溶性Fas实验可逆转肾癌细胞来源的exosomes对Jurkat T淋巴细胞凋亡的诱导作用。7、Fas/FasL，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2蛋白家族可能参与了肾癌细胞来源的exosomes对Jurkat T淋巴细胞凋亡的诱导。