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背景:系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种多因素系统性自身免疫性疾病,可累及皮肤、关节、中枢神经系统或肾脏等多个器官。尽管已发现激素、环境和遗传因素与SLE发病有关,但该病的发病机制仍需要进一步的探索。研究显示来自SLE患者的血液样本具有异常高的RNA编辑水平,其中一些会影响蛋白质翻译并可能产生新的自身抗原。RNA 腺苷脱氨基酶(Adenosine Deaminases Acting on RNA,ADAR)是一种可将腺嘌呤转化为次黄嘌呤的A至I编辑酶。哺乳动物中主要存在三种ADAR基因,其中ADAR1是第一个被识别并且表达最广泛的形式,是哺乳动物细胞中具有编辑酶活性的脱氨酶之一。它有两种亚型,ADAR1 p150(干扰素诱导型)和ADAR1 p110(组织表达型)。近期研究发现ADAR1基因突变与多种自身免疫性疾病的发病有关,包括 Aicardi-Goutieres 综合征(Aicardi-Goutieres Syndrome,AGS)和遗传对称性色素异常症(Dyschromatosis Symmetrica Hereditaria,DSH),这两种疾病均显示出与SLE的某些表型相似,例如AGS的特征在于Ⅰ型干扰素产生增加,并且AGS患者严重的自身免疫表现强调了 ADAR1在维持体内免疫平衡中的重要性。Nikolaos等研究者也证实在所有类风湿关节炎患者的滑膜组织及活动性患者的血液中有较高水平的ADAR1,经临床治疗取得良好疗效后患者体内ADAR1水平下降。此外,多名研究者分别在HeLa细胞、MCF7细胞和HEK293T细胞进行体外实验研究发现,IFN-α水平的改变可以调节ADAR1的表达。最近的多项热门研究显示,敲除ADAR1可导致一些癌细胞的生存能力降低,使得肿瘤细胞对免疫疗法敏感,并可克服对阻断检查点的抵抗,对于一些本身即可产生IFN的肿瘤细胞,更易受到ADAR1缺失的影响。在SLE的免疫系统中,血清Ⅰ型干扰素水平异常升高(主要是IFN-α)并参与发病,但其与ADAR1表达之间的相关性尚未明确,值得进一步探索。研究者已经证明,SLE患者的外周血单个核细胞(PBMCs)、T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞中ADAR1 p150表达水平上调。但目前国内外尚无关于不同疾病活动度SLE患者PBMCs中ADAR1表达的具体变化及其与血清IFN-α水平相关性的研究,本研究以此为基础进行了拓展研究。目的:本研究通过qRT-PCR技术检测SLE患者PBMCs及LN患者肾组织中ADAR1 mRNA表达水平,Elisa技术检测血清中IFN-α水平,旨在探讨以下问题:1.不同疾病活动度的SLE患者PBMCs中ADAR1表达水平的特异性改变及其与血清IFN-α水平的相关性。2.狼疮肾炎(Lupus Nephritis,LN)患者肾脏组织中ADAR1的表达特点。3.SLE患者PBMCs中ADAR1表达水平与临床指标的相关性。4.SLE患者中ADAR1与血清IFN-α间的作用机制及其在SLE中的作用。方法:本研究选取人PBMCs、肾组织和血清IFN-α为研究对象。1.收集PBMCs和血清:晨起空腹条件下,收集SLE患者(n=30)和健康志愿者(n=30)外周静脉血25毫升,并将5毫升血液转移至干燥的真空采血管中,20毫升血液转移至EDTA抗凝管中。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离抗凝管中血液的PBMCs细胞,采用低速离心法分离真空管中的血清。最后将收集到的样本在-80℃保存用于后续实验。2.收集肾组织标本:收集在我院肾内科行肾脏穿刺并明确诊断的LN患者肾组织样本30例。10例对照组肾组织标本来源于在我院泌尿外科行肾脏切除术的患者,从距离癌组织大于5cm的部位收集实验样本,肾小球病理显示正常且无肾功能不全的临床特征。3.检测ADAR1表达水平:采用qRT-PCR技术检测PBMCs和肾组织中ADAR1的mRNA表达水平,采用Western Blot方法检测体外实验中ADAR1的蛋白表达水平。4.检测血清IFN-α表达水平:采用Elisa技术检测血清中IFN-α表达水平。5.免疫组化实验:对20名LN患者(Ⅲ型n=5;Ⅳ型n=5;V型n=5;Ⅲ+Ⅴ型n=5)和5名对照组肾组织进行免疫组化分析,显示ADAR1在肾组织表达的阳性水平及其细胞定位特征。6.血清IgG的纯化:收集确诊为SLE的患者血清,使用ProteinIso(?)Protein G树脂分离并纯化SLE患者的血清IgG用于体外实验。7.体外细胞实验:使用上述方法从同一名健康志愿者外周静脉血中提取PBMCs,对细胞进行以下处理:(1)培养基中加入从SLE患者血清中纯化的IgG(1.5mg/mL)和不同浓度的IFN-α,共培养24小时;(2)在另一实验组中仅在培养基中加入不同浓度的IFN-α,与PBMCs共培养24小时。8.比较不同疾病活动度的SLE患者和对照组PBMCs中ADAR1的表达特点,并分析其与血清IFN-α表达水平的相关性,分析LN患者和对照组肾组织中ADAR1的表达特点。9.收集SLE患者和对照组的人口统计学、临床和肾脏病理学数据进行相关性分析。结果:1.PBMCs 中 ADAR1 表达特征:(1)SLE 患者(n=30)PBMCs 中 ADAR1表达水平高于对照组(n=30)(P<0.05)。(2)根据SLEDAI评分将SLE患者分为三组:NSLE(SLEDAI 0-4,n=6),LSLE(SLEDAI 5-9,n=12),SSLE(SLEDAI≥10,n=12),SSLE组的ADAR1表达水平显著高于NSLE组(P<0.05)和LSLE组(P<0.05)。(3)根据疾病对肾脏的影响,将患者分为SLE#组(#:未累及肾脏的SLE患者,n=17)和LN组(狼疮肾炎组,n=13),LN组患者PBMCs中ADAR1表达水平高于对照组(P<0.05)。2.肾组织中ADAR1表达特征:(1)qRT-PCR实验显示:对照组与LN组肾组织中ADAR1表达水平无明显差异(P>0.05)。(2)免疫组化实验显示:对照组(n=5)、LN组和不同病理亚组(Ⅲ型n=5;Ⅳ型n=5;V型n=5;Ⅲ+Ⅴ型n=5)之间ADAR1的细胞阳性率无明显差异(P>0.05)。在对照组和LN组中,肾小管细胞ADAR1的阳性表达率均高于肾小球细胞(P<0.05)。3.SLE患者PBMCs中ADAR1与血清IFN-α的相关性:当SLE患者的血清IFN-α水平<260.0pg/mL时,PBMCs中ADAR1表达水平与IFN-α水平呈正相关性(P<0.05),ADAR1 p150水平和血清IFN-α浓度形成曲线关系,当血清IFN-α水平达到100.0pg/mL时,ADAR1 p150水平达到峰值。在对照组中未观察到这种相关性变化。4.体外实验显示与IFN-α和SLE患者血清IgG共培养的PBMCs细胞中,ADAR1的表达特征与SLE患者中观察到的结果相似;仅与IFN-α共培养的PBMCs细胞中,未观察到上述相关性变化。此外,当IFN-α<200U时,ADAR1的主要组成成分是ADAR1 p150亚型,而当IFN-α>250U时,ADAR1 p110表达水平超过ADAR1 p150,成为此时ADAR1的主要组成成分。5.SLE患者PBMCs中ADAR1表达水平与SLEDAI评分(P<0.01)及24小时尿总蛋白水平(P<0.01)呈正相关性,与血清总蛋白(P<0.01)及血清白蛋白水平(P<0.05)呈负相关性。结论:1.SLE患者PBMCs中ADAR1抑制干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Genes,ISGs)表达的机制可能受损。2.SLE患者血清IgG可对IFN-α调节PBMCs中ADAR1表达此过程产生影响,此外IFN-α水平不同,ADAR1主要表达的亚型成分不同。3.SLE患者中ADAR1的表达具有组织差异性,PBMCs中的ADAR1或可成为一个评估疾病活动度的潜在生物标志物。4.本研究为进一步探索SLE发病机制提供了新线索,并为靶向药物的研发提供理论基础。