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由副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病,发病率和死亡率较高,给国内外养猪业带来了巨大的损失。因氟苯尼考(Florfenicol,FF)和盐酸多西环素(Doxycycline hydrochloride,Dox·HCl)的联合用药对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌具有较强的抗菌活性,已作为临床治疗猪传染性胸膜肺炎和副猪嗜血杆菌病的重要药物。为了科学规范Dox·HCl和FF联合用药在猪胸膜肺炎放线杆菌病和副猪嗜血杆菌病治疗上的应用并避免其耐药性的产生,通过药动学-药效学(Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD)模型预测和制定合理的用药方案尤为重要,同时也为复方药物PK-PD同步模型的研究提供参考。本课题利用PK-PD同步模型制定出前期研发出的盐酸多西环素-氟苯尼考(Doxycycline hydrochloride-florfenicol,Dox·HCl-FF)注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的临床给药方案,以期在取得最佳治疗效果的同时避免细菌耐药性的产生,为猪传染性胸膜肺炎和副猪嗜血杆菌病的治疗提供新的给药方案,充分发挥Dox·HCl-FF注射剂的临床应用价值,促进养殖业健康发展。1 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF分别对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的药效学研究FF、Dox·HCl和Dox·HCl-FF分别对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学研究本试验所用菌株为实验室保存的131株猪胸膜肺炎放线杆菌菌株。参考临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的琼脂稀释法测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对131株猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),得到FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对131株猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC90分别为8、8和2μg/m L。选出MIC90附近的胸膜肺炎放线杆菌进行血清型鉴定和小鼠毒力试验,最终选择编号为BW1的胸膜肺炎放线杆菌进行PK-PD实验。参考CLSI推荐的微量肉汤稀释法,测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对胸膜肺炎放线杆菌BW1在体外和半体内的MIC和最小杀菌浓度(Minmum bactericidal concentration,MBC),通过平板计数法测定防突变浓度(Minmum prevention concentration,MPC),绘制体外和半体内生长曲线和杀菌曲线。将不同浓度药物与胸膜肺炎放线杆菌BW1孵育1 h和2 h后测得抗菌后效应(Post-antibiotic effect,PAE)和耐药突变选择窗(Mutant selection window,MSW)。结果表明在体外和半体内条件下FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对胸膜肺炎放线杆菌BW1的MIC均为8、8和2μg/m L,MBC均为8、8和4μg/m L,MPC分别为19.2、19.2和6.4μg/m L,故MSW范围分别为8-19.2μg/m L、8-19.2μg/m L、2-6.4μg/m L。1 h和2 h的PAE结果分别为0.01-1.25 h和0.28-1.39 h;0.19-1.34 h和0.29-3.00 h;0.19-4.54 h和0.73-6.07 h。通过体外、半体内杀菌曲线和PAE发现FF对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用呈现浓度依赖性,Dox·HCl对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用既有时间依赖性又有浓度依赖性,当FF和Dox·HCl联用以后,随着Dox·HCl/FF浓度的增加,杀菌作用明显增强,表现出明显的浓度依赖性,因此最终选择AUC/MIC(药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值,area under the concentration-time by MIC)作为PK-PD拟合参数。FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对猪副猪嗜血杆菌的药效学研究本试验所用菌株为实验室保存的115株猪副猪嗜血杆菌。通过琼脂稀释法测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对115株猪副猪嗜血杆菌的MIC,得到FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对115株猪副猪嗜血杆菌的MIC90分别为4、4和1/1μg/m L。选出MIC90附近的副猪嗜血杆菌进行血清型鉴定和小鼠毒力试验,最终选择编号为55的副猪嗜血杆菌进行PK-PD实验。通过微量肉汤稀释法,测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对副猪嗜血杆菌55在体外和半体内的MIC,MBC,MPC和PAE。在体外和半体内条件下测得FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对副猪嗜血杆菌55的MIC值均为4、4和1/1μg/m L,MBC值均为8、8和2/2μg/m L,MPC值分别为12.8、12.8和4.8μg/m L,故MSW范围分别为4-12.8μg/m L、4-12.8μg/m L、1-4.8μg/m L。1 h和2 h的PAE结果分别为0.05-1.18 h和0.16-3.46 h;0.32-1.73 h和0.87-2.18 h;0.67-3.08 h和1.76-5.54 h。通过体外、半体内杀菌曲线和PAE发现FF对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用呈现浓度依赖性,Dox·HCl对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用既有时间依赖性又有浓度依赖性,当FF和Dox·HCl联用以后,随着Dox·HCl/FF浓度的增加,杀菌作用明显增强,表现出明显的浓度依赖性,因此最终选择AUC/MIC(药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值,area under the concentration-time by MIC)作为PK-PD拟合参数。2 Dox·HCl-FF注射剂在猪呼吸道的药动学研究Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌在猪呼吸道的药动学研究试验选取24头体重25 kg左右的健康断奶三元杂交仔猪,随机分为4组,每组6头,分别为FF健康组、Dox·HCl健康组,Dox·HCl/FF健康组和患病组。用胸膜肺炎放线杆菌临床分离株接种感染仔猪,建立人工感染的仔猪患病模型。4个组均按20 mg/kg b.w.肌内注射给药后,在不同时间点采集血浆和肺泡灌洗液样品,用高效液相色谱方法(High performance liquid chromatography,HPLC)分别测定血浆和肺泡灌洗液中游离的FF和Dox·HCl浓度,使用Winnonlin软件中的一级吸收二室模型对获得的药物浓度进行拟合,试验结果为单方FF健康组以及复方FF健康组和患病组在血浆中的达峰时间(Tmax)分别为3.41±0.27 h、3.45±0.21 h和3.67±0.08 h,达峰浓度(Cmax)分别为4.13±0.11μg/m L、4.08±0.09μg/m L和4.09±0.05μg/m L,24 h药时曲线下面积(AUC24h)分别为91.86±4.52 h·μg/m L、105.52±1.46 h·μg/m L和115.05±1.88h·μg/m L;单方Dox·HCl健康组以及复方Dox·HCl健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为1.86±0.14 h、1.97±0.06 h和2.04±0.07 h,Cmax分别为3.63±0.14μg/m L、3.58±0.07μg/m L和3.60±0.09μg/m L,AUC24h分别为68.20±3.98 h·μg/m L、72.77±1.41h·μg/m L和73.29±1.05 h·μg/m L;单方FF健康组以及复方FF健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为3.14±0.10 h、2.90±0.05 h和3.07±0.01 h,Cmax分别为8.03±0.20μg/m L、8.87±0.08μg/m L和8.67±0.07μg/m L,AUC24h分别为144.22±1.98 h·μg/m L、172.75±2.52 h·μg/m L和180.22±3.13 h·μg/m L;单方Dox·HCl健康组以及复方Dox·HCl健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为2.19±0.05 h、2.72±0.03 h和2.68±0.03 h,Cmax分别为7.68±0.07μg/m L、7.91±0.09μg/m L和7.99±0.05μg/m L,AUC24h分别为133.26±4.43 h·μg/m L、126.96±3.70 h·μg/m L和169.82±4.38 h·μg/m L。在血浆和肺泡液中,FF及Dox·HCl在单方的健康组以及复方的健康组和患病组的药动学参数均无显著差异。Dox·HCl-FF注射剂对猪副猪嗜血杆菌在猪呼吸道的药动学研究试验选取12头体重20 kg左右的健康断奶三元杂交仔猪,随机分为2组,每组6头,用副猪嗜血杆菌临床分离株接种感染仔猪,建立人工感染的仔猪患病模型。健康组和患病组均以20 mg/kg b.w.肌内注射给药后,在不同时间点采集血浆和肺泡灌洗液样品,用HPLC分别测定血浆和肺泡灌洗液中游离的FF和Dox·HCl浓度,使用Winnonlin软件中的一级吸收二室模型对获得的药物浓度进行拟合,得到复方FF健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为3.56±0.05 h和3.85±0.13 h,Cmax分别为4.18±0.05μg/m L和4.15±0.08μg/m L,AUC24h分别为104.38±3.29 h·μg/m L和111.51±1.79 h·μg/m L;复方Dox·HCl健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为1.91±0.07 h和2.16±0.05 h,Cmax分别为3.56±0.06μg/m L和3.65±0.06μg/m L,AUC24h分别为72.18±1.66 h·μg/m L和74.39±2.11 h·μg/m L;复方FF健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为3.39±0.06 h和3.41±0.18 h,Cmax分别为8.55±0.07μg/m L和8.33±0.07μg/m L,AUC24h分别为159.73±3.61 h·μg/m L和162.92±2.59 h·μg/m L;复方Dox·HCl健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为2.99±0.07 h和3.08±0.05 h,Cmax分别为7.35±0.03μg/m L和7.24±0.04μg/m L,AUC24h分别为145.43±2.89 h·μg/m L和152.34±1.06 h·μg/m L。在血浆和肺泡液中,复方FF和Dox·HCl在健康组和患病组的药动学参数均无显著差异。3半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌的半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定将半体内胸膜肺炎放线杆菌浓度变化对数值与健康和患病组的AUC24h/MIC值通过Sigmoid Emax模型进行拟合,获得复方FF健康组和患病组的参数,当E分别取0、-3和-4时获得相应的抑菌、杀菌和根除作用的AUC24h/MIC值分别为3.94、15.99、28.63 h(复方FF健康组),5.61、18.83、32.68 h(复方FF患病组);复方Dox·HCl健康组和患病组的参数,E分别取0、-3、-4时的AUC24h/MIC值分别为0.78、10.32、24.06 h(复方Dox·HCl健康组),7.42、19.64、31.08 h(复方Dox·HCl患病组)。由于患病组PK-PD参数更高,抗菌效果更好,按照患病组的数据,通过剂量公式,得到患病组预防、治疗和根除的剂量分别为1.37、4.59和7.99 mg/kg(复方FF患病组),1.92、5.08和8.04 mg/kg(复方Dox·HCl患病组)。Dox·HCl-FF注射剂对猪副猪嗜血杆菌的半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定将半体内副猪嗜血杆菌浓度变化对数值与健康和患病组的AUC24h/MIC值通过Sigmoid Emax模型进行拟合,获得复方FF健康组和患病组的参数,当E分别取0、-3和-4时获得相应的抑菌、杀菌和根除作用的AUC24h/MIC值分别为7.95、21.90、34.38 h(复方FF健康组),7.96、23.09、38.58 h(复方FF患病组);复方Dox·HCl健康组和患病组的参数,E分别取0、-3和-4时的AUC24h/MIC值分别为9.05、22.42、33.54 h(复方Dox·HCl健康组),9.27、23.73、37.70 h(复方Dox·HCl患病组)。由于患病组PK-PD参数更高,抗菌效果更好,按照患病组的数据,通过剂量公式,得到患病组的预防、治疗和根除剂量分别为1.07、3.11和5.21 mg/kg(复方FF患病组),1.34、3.42和5.43 mg/kg(复方Dox·HCl患病组)。Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌给药方案的制定为了更好的治愈胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌疾病,选出Dox·HCl-FF注射剂治疗这两种菌剂量中的较大者,即Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌的剂量方案,然后为了既能达到治疗效果又能节约用药量的目的,选择Dox·HCl/FF联合用药成分中的较小剂量即FF的剂量作为最终剂量方案,最终得到Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌病的预防、治疗和根除剂量依次为1.37、4.59和7.99 mg/kg。根据细菌生长动力学机制的PK-PD模型预测结果表明在治疗剂量下以24 h给药间隔,连续给药2天能达到预期疗效。