中药甘草(Radix Glycyrrhiza)是豆科植物甘草的干燥根和根茎,依据传统中医药理论,甘草性平味甘,归十二经,为药中“国老”。其药理作用显著且广泛,如解毒、解痉、止痛、祛痰、抗癌等。由于具有“调和诸药”的功效,甘草被广泛应用于传统中药的各种复方中,以至于有了“十方九草”的说法。已有研究表明甘草可通过调节肝脏CYP3A酶,诱导毒物代谢。同时有研究指出P-糖蛋白参与了甘草的解毒机制。P-糖蛋白作为细胞膜上的一种药物外排泵,负责将其底物主动转运出细胞,既然是主动运输,即决定了它的ATP依赖性。P-糖蛋白的外排泵转运功能若受到诱导,则有可能促进机体对于有毒物质的外排,实现保护机体的目的。而肝脏代谢是毒物在体内的清除途径之一,这是一个需要多种药物代谢酶参与催化的过程。比如肝细胞色素P450酶系(Cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase, GST)即可参与催化大多数药物在机体的代谢,故可通过调节其含量及活性以达到减毒增效的效果。因此,我们选择甘草总提物和甘草的主要活性成分甘草酸、甘草次酸作为实验药物,研究其对Caco-2细胞膜上P-糖蛋白的功能及表达,以及对HepG2细胞中CYP3A4、GSTs药物代谢酶的影响,以期探究甘草对P-糖蛋白和药物代谢酶可能存在的潜在调控机制。主要研究内容及结果如下：1.采用MTT比色法进行细胞毒性实验,结果显示甘草酸的浓度不大于40gM,甘草次酸的浓度不大于20μM,甘草总提物的浓度不大于10μg/mL时均对Caco-2细胞的生长抑制率≤20%,为非细胞毒性浓度；当甘草酸浓度不超过20μM,甘草次酸的浓度不超过10μM,甘草总提物的浓度不超过40μg/mL时,均对HepG2细胞的生长抑制率≤20%,因此为非细胞毒性浓度。故选取甘草酸的浓度梯度为1.6μM、8μM、40μM,甘草次酸的浓度梯度为20μM,甘草总提物的浓度梯度为0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL,以进行下一步P-糖蛋白部分的研究。药物代谢酶部分的研究则选取甘草酸的浓度梯度为0.8μM、2μM、10μM甘草次酸的浓度梯度为0.4μM、2μM.10μM,甘草总提物的浓度梯度为1.6μg/mL、8μg/mL、40μg/mL2.药物对P-糖蛋白功能的影响研究,阿霉素蓄积实验结果表明对照组Caco-2细胞中阿霉素荧光相对强度(MFI)为12.54,阳性对照组细胞内该值为19.96；而细胞经低、中、高浓度组的甘草酸处理后,胞内阿霉素MFI分别为9.85、9.06、8.84；细胞经甘草次酸处理后阿霉素MFI为9.56、9.15、8.82；浓度梯度的甘草总提物处理细胞后,胞内阿霉素MFI分别为8.61、7.88、7.52。罗丹明123蓄积实验结果表明Caco-2细胞经低、中、高浓度组的甘草酸处理后,胞内罗丹明123荧光相对强度(MFI)分别为27.99、19.89、13.6;甘草次酸组的Caco-2细胞内该值为29.02、20.68、12.29；细胞经梯度浓度的甘草总提物处理后,胞内MFI为23.55、20.75、15.35；空白对照组及阳性对照组细胞内罗丹明123MFI分别为28.9和42.68。罗丹明123外排实验的结果显示Caco-2细胞经低、中、高浓度组的甘草酸处理后,胞内罗丹明123MFI分别为19.24、15.34、13.56；甘草次酸组的Caco-2细胞内该值为18.2、15.07、12.9；细胞经梯度浓度的甘草总提物处理后,胞内MFI为17.28、13.2、10.67；空白对照组及阳性对照组细胞内罗丹明123MFI分别为18.3和36.68。这一系列数据显示甘草总提物及甘草酸、甘草次酸不仅能有效抑制Caco-2细胞中P-糖蛋白底物阿霉素和罗丹明123的蓄积,亦能显著诱导罗丹明123的外排(P<0.05、P<0.01或P<0.001),且具有浓度效应。3.结合半定量RT-PCR和实时定量PCR技术检测药物对P糖蛋白ABCB1基因的表达调控。半定量RT-PCR结果显示,甘草酸、甘草次酸和甘草总提物均能上调Caco-2细胞内ABCB1基因的转录水平。对照组细胞内ABCB1灰度值／β-actin灰度值之比为7.3%,经低、中、高浓度的甘草酸处理后,比值升高为8.5%、9.7%、10.7%；细胞经甘草次酸处理后,灰度比升高为21.1%、22.9%、30.4%；经甘草总提物处理后,灰度比值为20.5%、24.4%、35.7%。实时定量PCR的结果与半定量RT-PCR结果基本一致,经药物处理后细胞内ABCB1基因mRNA的表达水平比未处理组显著升高(P<0.05、P<0.01),且甘草酸和甘草次酸的中、高浓度组及甘草总提物的低、中、高浓度组均呈现出浓度依赖性,表明实验药物对细胞内P-糖蛋白ABCB1基因的转录具有诱导效应。4.结合流式细胞术和免疫荧光法检测药物对P-糖蛋白表达的调控,结果表明Caco-2细胞经低、中、高浓度组甘草酸处理后,细胞膜上P-糖蛋白表达量分别为11.91、12.27、13.19；经梯度浓度的甘草次酸处理后,该值分别为12.12、12.49、13.48；甘草总提物组的P-糖蛋白表达量的检测结果为13.0、13.69、15.15；空白对照组的值为7.33。数据显示甘草酸、甘草次酸及甘草总提物均能够显著诱导P-糖蛋白的表达(P<0.05),且具有剂量效应。5.药物对P-gp ATPase活性的影响研究,结果表明Caco-2细胞经梯度浓度的甘草酸、甘草次酸和甘草总提物处理后,P-gp ATPase酶活分别为3.25、10.47、15.33U/mgprot;3.31、12.45、25.62U/mgprot;3.38、13.67、21.44U/mgprot;对照组P-gp ATPase酶活为3.12U/mgprot。数据显示,中、高浓度组的甘草酸、甘草次酸和甘草总提物均可诱导P-gpATPase的活性(P<0.01或P<0.001),提示它们可能以此促进ATP的水解,保证对P-糖蛋白的供能,从而实现甘草对其外排功能的促进。6.通过对HepG2细胞中CYP450亚酶CYP3A4和GSTs酶活的检测,结果显示HepG2细胞经梯度浓度的甘草酸、甘草次酸和甘草总提物处理后,细胞中CYP3A4酶活分别为1.59、1.56、1.51nmol/mg. min;1.58、1.49、1.38nmol/mg· min;1.31、2.14、2.37nmol/mg·min;对照组值为1.75nmol/mg·min。而细胞中GSTs酶活分别为3.91、6.94、9.61U/mgprot;9.09、12.34、13.63U/mgprot;13.66、16.62、22.17U/mgprot;空白对照组的GSTs酶活为3.97U/mgprot。由此表明甘草酸、甘草次酸的低、中、高剂量,以及低剂量的甘草总提物均能抑制CYP3A4的酶活,且有显著性差异。而甘草总提物的中、高剂量组则能显著诱导CYP3A4活性(P<0.01)。甘草酸、甘草次酸和甘草总提物均能显著上调GST酶活性(P<0.05或P<0.01),同时具有浓度效应。与甘草酸和甘草次酸相比,甘草总提物对GST酶活的诱导效应最为显著。结论：甘草酸、甘草次酸和甘草提取物均可通过上调Caco-2细胞膜上P-糖蛋白ABCB1基因的转录和翻译水平,以及有效诱导P-gp ATPase酶活以保证对P-糖蛋白的能量供应,从而促进了P-糖蛋白的转运功能。因此推测甘草酸和甘草次酸可能是甘草诱导P-糖蛋白外排功能,从而促进P-pg介导的胞内毒物外排的主要成分。中、高浓度的甘草总提物能够显著增强药物代谢Ⅰ相酶CYP3A4的酶活(P<0.01),而甘草酸和甘草次酸则浓度依赖性的抑制CYP3A4的活性。推测甘草酸和甘草次酸并非甘草诱导CYP3A4活性的主要成分,而甘草作为CYP3A4的诱导剂,可能与其解毒作用有关。对于药物代谢Ⅱ相酶GSTs而言,甘草酸、甘草次酸和甘草总提物均能诱导其活性。本实验的研究成果可能为甘草解毒机制的研究提供了一定的理论基础。