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乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是乙型肝炎的病原体,是慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因之一。全世界有1,4人口生活于HBV流行区域,保守估计有3.5-4亿HBV慢性携带者,每年全球至少有100万人死于肝癌、肝硬化。
由于缺乏良好的细胞感染模型和实验动物模型,HBV的复制机制研究进展缓慢,尤其是复制起始阶段的细节还不清楚。目前对HBV感染的治疗仅限于干扰素和核苷(酸)类似物,而这二者在使用过程中存在应答低和容易产生耐药性等问题。因此,研究HBV的复制起始机制和筛选抗病毒药物对了解HBV的致病机制及研制新的治疗药物都是十分重要的。
本文第一章内容是是文献综述。首先简要介绍了HBV的结构、基因组、致病性和生活史,然后综述了HBVDNA的合成及转录调控机制、抗病毒靶点及药物研究进展。最后介绍了绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的生物学活性。
第二章内容是HBV复制起始相关细胞因子的分离鉴定研究。HBV复制起始的引发(Priming)尚不能在体外实验中进行,推测可能是由于HBVpgRNA5端ε二级结构稳定而不易被打开的缘故,而在细胞环境中,可能有多种细胞因子能结合ε并帮助ε打开其二级结构,保证HBV复制顺利起始。因此为了分离和鉴定与HBV复制起始引发相关的细胞因子,本研究使用体外制备的HBVε-RNA,通过亲和吸附从HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15的胞质提取液中分离得到了若干能特异性与ε-RNA结合的细胞因子。我们推测这些细胞因子可能在HBV复制过程中起作用,其功能验证尚在进行之中。
第三章内容是HBV抗病毒药物筛选及药物抗病毒机理研究。首先利用HepG2.2.15细胞系,筛选了52种天然小分子化合物,得到了两种对HBV抗原表达有抑制作用的药物:flavopiridol和EGCG。进一步的实验研究表明,flavopiridol并不能抑制HBVDNA合成;至于EGCG,已有文献报道其具有抑制HBVDNA合成和蛋白表达的活性,但其作用机制并未阐明。因此,我们将工作调整到EGCG的抗HBV作用机制研究上。文献研究表明,EGCG能影响多个信号通路,其中尤以对MAPKs通路的抑制作用具有广泛的生物学影响。本实验结果表明,EGCG在HepG2.2.15细胞中可以明显抑制ERK和p38MAPK的磷酸化水平。pERK的下调抑制了HBeAg的表达,但对HBsAg没有影响。p-p38的下调对两种抗原的表达都没有抑制。结果提示EGCG可以通过抑制ERK的激活而抑制HBeAg的表达,而EGCG对HBsAg表达的抑制与这ERK、p38信号通路均无关。接下来分析了EGCG对HBV核心蛋白启动子活性的影响,结果表明在转染了HBVCP的Huh7细胞中,EGCG可以抑制HBVCP活性,进一步研究证实HBVCP活性下降与pERK水平的下调有关。以上发现对进一步了解EGCG的抗HBV作用机制具有重要意义。