【摘 要】
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曲酸是一种由曲霉属真菌发酵产生的弱酸性次级代谢产物,具有抑菌、抗氧化、抑制多酚氧化酶等生物活性,广泛应用于食品、化妆品以及医药等产业。随着曲酸应用领域的扩大,发酵法生产曲酸成为发酵有机酸的重要研究方向。本实验以米曲霉3.042作为出发菌株,对细胞核DAPI染色条件进行优化,当采用75%乙醇预处理细胞壁40 min,用浓度为12μg/m L的DAPI染料在避光条件下染色80 min时,孢子内细胞核在
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曲酸是一种由曲霉属真菌发酵产生的弱酸性次级代谢产物,具有抑菌、抗氧化、抑制多酚氧化酶等生物活性,广泛应用于食品、化妆品以及医药等产业。随着曲酸应用领域的扩大,发酵法生产曲酸成为发酵有机酸的重要研究方向。本实验以米曲霉3.042作为出发菌株,对细胞核DAPI染色条件进行优化,当采用75%乙醇预处理细胞壁40 min,用浓度为12μg/m L的DAPI染料在避光条件下染色80 min时,孢子内细胞核在紫外激发光下呈现明亮蓝色荧光。通过观察分析得到米曲霉3.042单核孢子的比例为19%,双核孢子的比例为72%,三核及以上孢子的比例为9%。通过孢子萌发5 h后,过滤掉菌丝,收集未萌发孢子的方法富集单核孢子,富集后的单核孢子比例为67%,其余均为双核孢子,单核孢子概率明显增加。首先对米曲霉3.042进行紫外线照射诱变,筛选后得到突变菌株UV15,产量为28.76 g/L。然后对突变株UV15进行超声波微波复合诱变,通过筛选后得到高产菌株M22,产量为34.28 g/L,与出发菌株米曲霉3.042相比曲酸产量提高了197%,与UV15相比曲酸产量提高了19.2%。且经传代培养10代后,曲酸产量及表型稳定。通过单因素试验法确定曲酸发酵培养基的最优碳、氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨,在单因素实验的基础上进行正交优化培养基成分,优化后的培养基为:12%蔗糖、0.4%大豆蛋白胨、0.2%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、0.1%硫酸锰、0.06%钼酸钠。通过单因素实验法确定发酵条件为:发酵时间7 d、装液量80 m L、种龄36 h、接种量1×10~5个/m L、p H值4.5、转速250 r/min。在单因素实验基础上对其进行响应面优化,优化后的发酵条件为装液量80.40 m L、发酵天数7.11 d、种龄36.42 h,通过验证实验测得曲酸产量为34.1 g/L,与预测值33.49 g/L相差不大,说明此模型可适用于曲酸发酵的理论推测。在30 L发酵罐放大实验中,曲酸产量在132 h达到最高值为27.33 g/L。对发酵液中曲酸的提取进行了工艺优化,通过大孔苯乙烯系螯合型树脂D401对发酵液进行脱色处理,当流速为5 m L/min时为最佳流速,此时曲酸脱色率为91.6%、回收率为95.3%,此时用肉眼观察溶液已接近无色透明或成微黄色。采用直接浓缩结晶法进行提取,当浓缩掉50%水分时曲酸提取效果最好,此时提取率为90.2%、产品纯度为99.12%。
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