【摘 要】
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目的:血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）在血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发病过程中起着重要作用。ADAMTS13的功能异常可能会导致TTP的发生,但ADAMTS13在TTP中的作用机制尚不明确,因此本实验研究了ADAMTS13中的间隔区（Spacer）结构域在血管性血友病因子（v WF）裂解过程中的生物学功能,为TTP发病机制的研究提供理论依据。方法:1.将ADAMTS13 Space
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目的:血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）在血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发病过程中起着重要作用。ADAMTS13的功能异常可能会导致TTP的发生,但ADAMTS13在TTP中的作用机制尚不明确,因此本实验研究了ADAMTS13中的间隔区（Spacer）结构域在血管性血友病因子（v WF）裂解过程中的生物学功能,为TTP发病机制的研究提供理论依据。方法:1.将ADAMTS13 Spacer结构域中的TEDRLPR氨基酸残基以点突变的技术逐个基因突变,制备突变体质粒,将构建好的ADAMTS13与其突变体质粒转染至HEK293细胞中,使用western blot方法检查蛋白表达程度并使用G418筛选收集细胞稳定表达的ADAMTS13及其突变体的重组蛋白上清液,经由Q-fast flow离子结合柱,Ni-NTA亲和层析柱和分子筛后最终得到纯化的重组蛋白。2.将重组蛋白用1%Sea Kem HGT琼脂糖凝胶分离后用western blot方法观察野生型和突变型ADAMTS13在1.5M尿素或guanidine-HCl的变性条件下或利用振荡器产生的剪切应力作用下或加入ADAMTS13抗体后其裂解v WF的活性变化。结果:1.成功构建了ADAMTS13突变体质粒（M1:Thr632A;M2:Glu633A;M3:Asp634A;M4:Arg635A;M5:Leu636A;M6:Pro637A;M7:Arg638A）。2.野生型与突变型ADAMTS13质粒在HEK293细胞中稳定表达,并且提纯蛋白。3.突变体M4与M7对FRETS-v WF73的剪切能力比野生型ADAMTS13对其剪切能力降低明显（P＜0.05）。4.变性条件中,野生型ADAMTS13几乎可以将v WF多聚体完全裂解,而突变体M4与M7的裂解活性显著降低（P＜0.01）。5.体外剪切应力作用下,突变体M4与M7裂解v WF多聚体的能力与野生型ADAMTS13相比降低明显（P＜0.01）。6.对比野生型ADAMTS13,突变体M4与M7跟v WF之间的结合力未有显著降低,表明ADAMTS13的C末端和v WF之间存在多个结合位点。7.加入ADAMTS13抗体后在一定程度上抑制了野生型和突变型ADAMTS13的功能。结论:1.间隔区突变后的ADAMTS13活性降低。2.M4（Arg635）与M7（Arg638）可能是ADAMTS13在底物识别时的重要作用位点。
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