诱变育种是农作物遗传改良的重要方式之一,本实验室前期建立了大豆EMS诱变突变体库,获得了大量的用于重要功能基因挖掘和分子育种的突变体。在突变体库中筛选得到一个黄化弱小的突变体Gmyld1。前期已经对Gmyld1进行了遗传分析,确定它们是单基因控制的隐性纯合突变,并初步定位了该突变位点。在此基础上,对Gmyld1进行突变基因精细定位、等位系构建、基因功能鉴定研究及RNA-seq分析,为进一步揭示该基因功能的调控机制,培育具有优良性状的高产、抗病新品种奠定基础。主要研究过程及实验结果包括:1、大豆黄化突变体Gmyld1的表型鉴定农艺性状及考种数据分析表明,与野生型大豆荷豆12（H12）相比,突变体Gmyld1表现出叶片黄化的表型。其幼叶呈金黄色,随着叶片成熟,叶色逐渐转为浅绿色叶。Gmyld1株高较矮,节数、单株结荚数、单株粒数均减少,但种子大小以及百粒重无显著差异。进一步分析发现Gmyld1叶片色素含量减少,叶绿体类囊体排列紊乱,基粒片层数较少。石蜡切片比较发现,Gmyld1茎顶端生长点由营养生长向生殖生长的转折时间要晚于野生型。2、Gmyld1突变基因精细定位及克隆实验室前期遗传分析确定该突变性状受单个隐性核基因控制,并利用Gmyld1与Williams82杂交的F2代群体粗定位确定突变基因位于20号染色体0.90Mb区间内,并利用Gmyld1回交F2群体进行了 BSA测序。本研究进一步经过扩大F2:3代群体,利用1564个突变单株,将突变基因精细定位在20号染色体的68kb区间内,该区间内包含6个注释基因。对Gmyld1及野生型中6个候选基因测序比对发现,其中一个候选基因GmYLD1基因CDS的+1629碱基位点发生碱基C-T的替换,导致其编码氨基酸由P（脯氨酸）-S（丝氨酸）。BSA-seq数据分析获得1个候选区间,总长度为2.27Mb,发生非同义突变的SNP位点有3个,其中Gm YLD1基因CDS的+1629碱基位点正是三个非同义SNP位点之一。推测该位点突变是引起了大豆叶色黄化的原因,该基因为调控叶色的候选基因。序列分析发现,GmYLD1属于R家族的抗病基因GmNB-ARC-LRR1。亚细胞定位发现,GmYLD1编码的蛋白质位于细胞质中,且Gm YLD1的同源基因主要位于大豆、菜豆和蒺藜苜蓿类豆科植物中。3、候选基因GmYLD1的功能验证Gmyld1等位系的筛选及分子鉴定:为进一步验证通过图位克隆分离的Gm YLD1的准确性,本研究从EMS诱变突变体库的M3代（黄叶:绿叶=1:3）株系中筛选了 8株黄化弱小的突变体,并对这些突变体进行GmYLD1序列比对,发现除1株与GmYLD1突变位点相同外,其他7株分别在GmYLD1 CDS序列不同位点发生不同核苷酸突变:666位T-C、816位 T-A、906 位 T-C、930 位 A-T、1164 位 A-T、1209 位 G-A、1288 位 C-T、1392 位 C-T,表明它们是Gmyld1等位系。GmYLD1编辑植株的构建及分子鉴定:将GmYLD1的CRISPR-Cas9载体pGmYLD1-Psc1通过农杆菌转化法转入大豆荷豆12中,经Basta筛选及基因片段测序,获得4个转基因T1代株系,共24株编辑植株,其中6株叶色呈黄色,表明GmYLD1-Psc1编辑植株出现了 Gmyld1的叶黄化突变表型。Gmyld1恢复系的构建及分子鉴定:将过表达载体p35S::GmYLD1通过农杆菌转化法转入大豆突变体Gmyld1中,经Basta筛选和PCR鉴定,获得4个p35S::GmYLD1 in Gmyld1的T1代大豆株系,共36株,其中8株叶色呈绿色,其GmYLD1片段序列出现双峰,GmYLD1基因整合进Gmyld1基因组,表明GmYLD1过表达恢复了Gmyld1的叶黄化表型。4、GmYLD1基因在抗疫霉菌的作用GmYLD1是R家族的抗病基因,为此对Gmyld1及野生型进行了疫霉菌侵染实验。使用疫霉菌孢子悬液注射H12和Gmyld1的叶片,发现与野生型H12相比,Gmyld1子叶水渍状病斑面积较小,且白色疫霉菌丝分布少。台盼蓝染色发现,与H12相比,Gmyld1染色区域明显减小,死亡率小于对照,表明突变体Gmyld1对疫霉菌具有较强的抗性。为了揭示该基因调控抗疫霉菌的分子机制,对突变体Gmyld1和H12进行了转录组测序,结果表明与野生型相比,Gmyld1中上调表达基因511个,下调表达基因265个。其中抗病相关基因有39个,上调表达31个,下调表达8个。另外,在α-亚麻酸合成代谢途径、MAPK信号通路、植物激素信号转导通路、植物-病原菌互作通路中多个基因出现表达差异,上述结果为进一步解析Gmyld1调控抗疫霉菌的分子机制奠定了基础。