胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各类恶性肿瘤之首，严重威胁着人民群众的生命健康。目前胃癌的治疗主要以早期诊断、早期手术为主，辅以化疗、放疗、生物免疫治疗等手段，但是适用于胃癌的有效的抗癌药物为数不多，疗效也不尽理想。单一化疗的有效率仅为20％左右，即使行胃癌根治性切除术，仍有30％的胃癌病人术后出现肿瘤复发。晚期胃癌则以化疗为主要治疗手段，但是由于多药耐药的产生，疗效往往不佳。因此，寻求和开发能提高胃癌治疗疗效的药物，一直是医学界研究的热点。 随着生命科学的发展，人们逐渐认识到肿瘤是多步骤、多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所导致的一类疾病，而且已知的几乎所有癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都通过不同的途径会聚到细胞周期机制上来，这些基因功能改变的最终结果是使正常细胞获得失控性生长的特点，转化为恶性细胞，形成肿瘤。胃癌的病因和发病较为复杂，至今尚未完全明了，可以肯定的是胃癌的发生发展与遗传、饮食、感染及其它环境因素有一定的关系。饮食中的富含亚硝酸盐类的腌制食品，幽门螺旋杆菌与Epstein-Barr病毒的感染是胃癌发生中不可忽视的后天环境因素。在促癌因素的作用下，癌基因的激活、抑癌基因的失活或者突变表达、以及胃癌宿主的自身免疫状态等因素，在胃癌的发生发展中具有极为重要的意义。已有的研究结果表明，在胃癌的发生过程中也同样存在着细胞周期调控机制的渐进的紊乱。因此，加强对胃癌细胞周期调控机制的研究，有助于深入了解胃癌的发病机理，有助于形成以细胞周期调控因子为治疗靶向的抗癌治疗策略。 中医中药在防治胃癌，改善胃癌临床症状和体征，抑制胃癌的浸润和转移，提高胃癌病人的生存质量及延长胃癌病人的生存期等方面具有较大的潜力。近年来，随着分子生物学的发展，很多学者在胃癌的中医辨证分型、辨证论治等基础和应用领域进行了大量的研究，深入地探讨了胃癌中医证型的物质基础，以及中医药防治胃癌的可能机制，对阐明中医药抗癌机理以及开发抗胃癌新药提供了科学的理论基础。 我们以往的研究表明，中药胃康宁能抑制胃癌细胞p53、VEGF及其受体的表达，并将细胞阻滞于G0-G1期。本项目在以往研究的基础上，采用具有健脾化痰、清热解毒、理气活血、消瘀散结功效的中药复方胃康宁制备含药血清，并用含药血清培养人胃癌细胞株，观察其对人胃癌细胞周期调控因子表达的影响，以期阐明中药胃康宁抗胃癌的作用机制。 第一部分中药胃康宁对胃癌细胞Cyclins表达的影响 目的：观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞CyclinD1、CyclinD2、CyclinE表达的影响。方法：分别以高，中，低不同剂量的胃康宁制剂对SD大鼠进行灌胃，制备含药血清，然后分别用不同剂量组含药血清培养胃癌细胞，采用免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中CyclinD1、CyclinD2和CyclinE蛋白的表达，RT-PCR法检测各组胃癌细胞中CyclinD1、CyclinD2和CyclinEmRNA的表达。结果：SABC免疫组化法检测表明：CyclinD1免疫组化染色的灰度值在空白对照组、胃康宁高、中、低剂量组分别为170.69±0.79、171.31±1.09、175.90±3.96、171.82±2.39(P＞0.05)。CyclinD2的灰度值在对照组为145.31±1.83，中、高剂量组为158.01±1.62、169.51±1.71(P＜0.01)；CyclinE的灰度值由对照组的145.83±0.78降低到低剂量组的145.80±0.39，中剂量组的139.90±0.66，高剂量组的135.31±0.59(P＜0.01)。RT-PCR检测表明：CyclinD1mRNA的OPTDI值在空白对照组、血清对照组和胃康宁低、中、高剂量组分别为的1.20±0.35、1.22±0.34、1.03±0.22、1.11±0.29、1.02±0.49(P＞0.05)；CyclinD2mRNA的OPDTI值在胃康宁高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.31±0.19、0.39±0.20、0.44±0.18和0.68±0.22(P＜0.01)；CyclinEmRNA的OPTDI值在高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.15±0.09、0.25±0.11、0.40±0.13和0.46±0.19(P＜0.01)。结论：中药胃康宁可剂量依赖地显著抑制胃癌细胞CyclinD2和CyclinEmRNA和蛋白的表达；而抑制胃癌细胞CyclinD1mRNA和蛋白表达的作用较弱。 第二部分中药胃康宁对胃癌细胞Cdks表达的影响 目的：观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞Cdk4、Cdk6、Cdk2表达的影响。方法：分别以高，中，低不同剂量的胃康宁制剂对SD大鼠进行灌胃，制备含药血清，然后分别用不同剂量组含药血清培养胃癌细胞，采用免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中Cdk4、Cdk6和Cdk2蛋白的表达，RT-PCR法检测各组胃癌细胞中Cdk4、Cdk6和Cdk2mRNA的表达。结果：SABC免疫组化检测表明：Cdk4的免疫组化染色的灰度值由对照组144.52±0.20升高到低剂量组的161.80±0.66，中剂量组的178.65±0.52，高剂量组的182.22±0.57(P＜0.01)；Cdk6的灰度值由对照组的144.55±0.70升高到低剂量组的148.33±0.63，中剂量组的158.01±0.72，高剂量组的169.04±0.61(P＜0.01)。Cdk2的的灰度值由对照组的140.31±0.71升高到低剂量组的145.20±0.69，中剂量组的160.01±0.62，高剂量组的169.51±0.71(P＜0.01)。RT-PCR检测表明：Cdk4mRNA表达的OPTDI值在空白对照组、血清对照组和胃康宁低、中、高剂量组分别为的0.45±0.17、0.46±0.23、0.42±0.21、0.35±0.15、0.30±0.11(P＞0.05)；Cdk6mRNA的OPDTI值在胃康宁高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.29±0.14、0.30±0.12、0.43±0.18和0.42±0.20(P＜0.01)；Cdk2mRNA的OPTDI值在在高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.19±0.11、0.22±0.09、0.24±0.10和0.35±0.13(P＜0.01)。结论：除对Cdk4mRNA表达的抑制作用较弱外，中药胃康宁可剂量依赖地抑制胃癌细胞Cdk6和Cdk2mRNA和蛋白的表达；也剂量依赖地抑制Cdk4蛋白的表达。 第三部分中药胃康宁对胃癌细胞Ckis表达的影响 目的：观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞p16INK4a和p27KIP1表达的影响。 方法：分别以高，中，低不同剂量的胃康宁制剂对SD大鼠进行灌胃，制备含药血清，然后分别用不同剂量组含药血清培养胃癌细胞，采用免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中p16INK4a和p27KIP1蛋白的表达，RT-PCR法检测各组胃癌细胞中p16INK4a和p27IP1mRNA的表达。结果：SABC免疫组化检测表明：p16INK4a的免疫组化染色的灰度值在对照组、胃康宁低、中剂量组分别为155.22±0.57、145.80±0.56、145.80±0.56，其组间比较无显著性(P＞0.05)，在胃康宁高剂量组为130.52±0.59与对照组相比，差异显著(P＜0.01)。p27KIP1的灰度值由对照组的167.69±0.79降低到低剂量组的145.80±0.39，中剂量组的139.90±0.66，高剂量组的135.31±0.59(P＜0.01)。RT-PCR检测表明：p16INK4amRNA的OPDTI值在高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.39±0.18、0.35±0.23、0.32±0.25、0.25±0.21(P＞0.05)。p27KIP1mRNA的OPDTI值在高、中、低剂量组和空白对照组分别为0.42±0.15、0.38±0.11、0.30±0.13和0.18±0.10(P＜0.01)。结论：中药胃康宁含药血清增强胃癌细胞p16INK4amRNA表达的作用较弱，而高剂量胃康宁能显著增加胃癌细胞中p16INK4a蛋白的表达；中药胃康宁含药血清能增强胃癌细胞p27KIP1mRNA和蛋白的表达，并呈一定的量效关系。 结论：1.中药胃康宁含药血清抑制胃癌细胞促细胞周期相关因子CyclinD2mRNA和蛋白的表达，抑制Cdk4蛋白的表达和Cdk6mRNA和蛋白的表达，并呈一定的量效关系；同时增强胃癌细胞p16INK4a蛋白表达。表明中药胃康宁通过调节CyclinD2-Cdk4/6-p16INK4a细胞周期调控因子，将胃癌细胞阻滞于G0-G1期。 2.中药胃康宁含药血清抑制胃癌细胞促细胞周期相关因子CyclinE及Cdk2mRNA和蛋白的表达，增强p27KIP1mRNA和蛋白的表达，并呈一定的量效关系。表明中药胃康宁通过调节CyclinE-Cdk2-p27KIP1细胞周期调控因子，将胃癌细胞阻滞于G0-G1期的又一个环节。