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新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）是一种呈球形、有囊膜的RNA病毒，具有单股、负链、不分节段的RNA基因组。该病毒也是引起家禽养殖业重大经济损失的一种禽类病毒。NDV作为一种很重要的溶瘤病毒，能够在肿瘤细胞中选择性复制，引起肿瘤细胞凋亡。目前研究表明，NDV感染诱导内源性和外源性细胞凋亡，且通过诱导死亡配体TNFα和TRAIL的表达介导外源性细胞凋亡。然而，NDV感染如何引起内源性细胞凋亡还没有系统、具体的报道。
内质网（endoplasmic reticulum，ER）压力应激，也称为未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR），是指在营养不足、钙离子失衡、病毒感染等不同的生理和/或病理条件下，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔中的蓄积，以及内质网功能的紊乱所引起的应答反应。3种跨内质网膜的ER应激感受蛋白已被鉴定，包含PKR样ER调节激酶（protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase，PERK）、转录激活因子6（activating transcription factor6，ATF6）和肌醇需酶1α（inositol requiring enzyme1α，IRE1）。
RNA病毒感染宿主细胞后，蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）通过识别病毒dsRNA被激活或PERK通过病毒引起的ER应激而被激活，进而磷酸化eIF2α，抑制蛋白翻译起始，而增强活化转录因子ATF4（activating transcription factor4）的翻译，诱导促凋亡蛋白CHOP（又称GADD153或DDIT3）表达。
IRE1α-XBP1信号通路是真核生物中进化最保守的信号通路。ER应激下，IRE1α能够形成寡聚体，自身磷酸化被激活，其激酶活性和核酸内切酶活性发挥作用。IRE1α的核酸内切酶活性裂解26nt从底物X-盒结合蛋白1（X box-binding protein1，XBP1）mRNA，形成XBP1s mRNA，编码一种活化转录因子XBP1s。XBP1s能够调控参与蛋白质折叠、分泌，ERAD和脂质代谢等相关基因表达。
IRE1α也参与细胞内RNAs降解，也称为依赖于IRE1调控的降解（regulated IRE1-dependent decay,RIDD），其底物包括位于ER的mRNAs、核糖体RNA和microRNA。激活的IRE1α通过降解miR-17使硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin-interacting protein，TXNIP）mRNA转录后更稳定，有利于TXNIP蛋白表达。TXNIP能够与硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）互作，释放与Trx互作的凋亡信号激酶1（apoptosis signal kinase1，ASK1），游离的ASK1被磷酸化激活，进而通过激活JNK和p38MAPK信号通路，介导细胞凋亡。
活化的IRE1α募集接头蛋白TRAF2，TRAF2可以招募ASK1，能够通过激活ASK1-JNK通路引起细胞凋亡。目前有许多关于病毒通过UPR介导细胞凋亡的研究，为了探究NDV是否也通过该通路介导细胞凋亡，其作用机制是怎样的，UPR对病毒的复制起怎样作用，进行了以下研究：
（1）NDV感染与CHOP通路和IRE1α通路的激活；为了研究NDV感染HeLa细胞后能否激活CHOP和IRE1α信号通路，用NDV强毒株Hert s/33感染人宫颈癌细胞系HeLa细胞后，用免疫荧光和Western blot方法检测该通路是否被激活。结果表明，NDV感染后12-24h，促凋亡蛋白CHOP被显著诱导表达，且病毒感染后主要聚集在细胞核内；IRE1α被磷酸化激活，其下游产物XBP1s也被显著表达，在病毒感染后有部分入核，可以分布于细胞质和细胞核内；为了进一步证明CHOP是由PERK通路介导的，还是由PKR通路介导的？用PERK/PKR抑制剂GSK2606414处理之后检测CHOP变化，结果表明NDV感染通过PKR-eIF2α信号通路，诱导CHOP表达。以上结果表明NDV感染能够激活CHOP和IRE1α信号通路。
（2）CHOP信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了探究CHOP通路对NDV增殖和细胞凋亡影响，用NDV感染、干扰CHOP和外源表达CHOP，Western blot结果表明NDV感染下调表达抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1，激活AKT以及ERK1/2、JNK和p38MAPKs信号通路。siCHOP能够显著抑制NDV病毒蛋白NP表达，同时，细胞上清中的病毒滴度也降低；上调表达抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1，而抑制促凋亡JNK、p38信号通路的激活，进而减少PARP剪切和细胞凋亡；过表达CHOP能够增加病毒蛋白表达，而细胞上清中病毒滴度的变化不明显；CHOP表达可以抑制促存活蛋白AKT激活，减少抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1表达，而显著激活JNK，增加PARP剪切，促进细胞凋亡。以上结果表明CHOP有利于病毒增殖，且通过调控BCL-2家族蛋白，MAPKs和AKT信号通路，促进凋亡。
（3）IRE1α-XBP1信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了研究IRE1α对NDV复制、细胞凋亡的影响，干扰IRE1α后，用Western blot和qRT-PCR方法检测对病毒复制、细胞凋亡的影响。结果表明caspase-3和PARP的剪切减少，明显降低病毒蛋白NP的转录和表达，且下调UPR相关基因EDEM1、ERdj4、p58IPK的转录；过表达IRE1α，caspase-3和PARP的剪切增加，上调ERdj4、p58IPK的转录，增加病毒蛋白NP的转录和表达。为了进一步研究IRE1α是否通过XBP1通路调控病毒复制和细胞凋亡，将XBP1基因进行干扰，发现siXBP1抵抗病毒诱导凋亡，抑制病毒增殖。以上结果证明IRE1α通过调控XBP1s的转录表达，以及上调UPR相关基因EDEM1、ERdj4、p58IPK的转录，促进病毒复制，增强NDV感染诱导宿主细胞的凋亡。
（4）IRE1α-TXNIP信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了研究NDV感染对IRE1α-TXNIP信号通路介导细胞凋亡的影响，NDV感染HeLa细胞，Western Blot和IFA检测TXNIP变化情况。结果表明NDV感染通过激活IRE1α，调控TXNIP蛋白表达。干扰和外源表达TXNIP实验结果表明，TXNIP不利于病毒增殖；同时，qRT-PCR检测IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-8，结果表明TXNIP下调细胞因子的转录。以上结果表明，NDV感染可以通过激活IRE1α-TXNIP信号通路，调控病毒复制和宿主细胞凋亡。
（5）NDV感染与JNK信号通路的关系；NDV感染HeLa细胞能够磷酸化激活JNK，使其入核。为了研究NDV感染如何调控JNK信号通路，干扰IRE1和外源表达IRE1α，以及NF-κB抑制剂IKK16处理HeLa细胞，Western blot结果显示siIRE1抑制JNK的磷酸化，而过表达IRE1α促进JNK激活；IKK16处理细胞显著抑制JNK磷酸化；结果表明NDV感染可以通过调控IRE1α和NF-κB信号通路激活JNK。
JNK是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以参与调控炎症反应、细胞增殖、分化和凋亡等生理过程。为进一步研究JNK通路对病毒增殖和凋亡影响，用特异性siRNA干扰JNK和用JNK抑制剂sp600125处理细胞，结果显示siJNK抑制病毒蛋白的转录和表达，也抑制NF-κB信号通路的激活，TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-β的转录显著降低，PARP和caspase-3的剪切减少；与此结果相一致，sp600125处理细胞也抑制病毒蛋白的转录和表达，明显抑制炎性因子的转录，且PARP剪切减少。以上结果表明NDV感染可以通过激活IRE1α/NF-κB-JNK通路，促进细胞凋亡和炎症反应，有利于病毒增殖。
本文中，主要探究了在NDV感染的肿瘤细胞中，有关内质网应激反应介导的相关凋亡。结果显示，NDV可以通过调控或激活UPR诱导的相关转录因子，如CHOP、XBP1s和促凋亡MAPKs信号，诱导细胞凋亡。NDV感染可以通过诱导表达促凋亡蛋白CHOP和激活IRE1α-XBP1s/JNK信号通路介导凋亡。除IRE1α-TXNIP通路之外，这些UPR分支活化有利于NDV增殖。
内质网（endoplasmic reticulum，ER）压力应激，也称为未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR），是指在营养不足、钙离子失衡、病毒感染等不同的生理和/或病理条件下，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔中的蓄积，以及内质网功能的紊乱所引起的应答反应。3种跨内质网膜的ER应激感受蛋白已被鉴定，包含PKR样ER调节激酶（protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase，PERK）、转录激活因子6（activating transcription factor6，ATF6）和肌醇需酶1α（inositol requiring enzyme1α，IRE1）。
RNA病毒感染宿主细胞后，蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）通过识别病毒dsRNA被激活或PERK通过病毒引起的ER应激而被激活，进而磷酸化eIF2α，抑制蛋白翻译起始，而增强活化转录因子ATF4（activating transcription factor4）的翻译，诱导促凋亡蛋白CHOP（又称GADD153或DDIT3）表达。
IRE1α-XBP1信号通路是真核生物中进化最保守的信号通路。ER应激下，IRE1α能够形成寡聚体，自身磷酸化被激活，其激酶活性和核酸内切酶活性发挥作用。IRE1α的核酸内切酶活性裂解26nt从底物X-盒结合蛋白1（X box-binding protein1，XBP1）mRNA，形成XBP1s mRNA，编码一种活化转录因子XBP1s。XBP1s能够调控参与蛋白质折叠、分泌，ERAD和脂质代谢等相关基因表达。
IRE1α也参与细胞内RNAs降解，也称为依赖于IRE1调控的降解（regulated IRE1-dependent decay,RIDD），其底物包括位于ER的mRNAs、核糖体RNA和microRNA。激活的IRE1α通过降解miR-17使硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin-interacting protein，TXNIP）mRNA转录后更稳定，有利于TXNIP蛋白表达。TXNIP能够与硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）互作，释放与Trx互作的凋亡信号激酶1（apoptosis signal kinase1，ASK1），游离的ASK1被磷酸化激活，进而通过激活JNK和p38MAPK信号通路，介导细胞凋亡。
活化的IRE1α募集接头蛋白TRAF2，TRAF2可以招募ASK1，能够通过激活ASK1-JNK通路引起细胞凋亡。目前有许多关于病毒通过UPR介导细胞凋亡的研究，为了探究NDV是否也通过该通路介导细胞凋亡，其作用机制是怎样的，UPR对病毒的复制起怎样作用，进行了以下研究：
（1）NDV感染与CHOP通路和IRE1α通路的激活；为了研究NDV感染HeLa细胞后能否激活CHOP和IRE1α信号通路，用NDV强毒株Hert s/33感染人宫颈癌细胞系HeLa细胞后，用免疫荧光和Western blot方法检测该通路是否被激活。结果表明，NDV感染后12-24h，促凋亡蛋白CHOP被显著诱导表达，且病毒感染后主要聚集在细胞核内；IRE1α被磷酸化激活，其下游产物XBP1s也被显著表达，在病毒感染后有部分入核，可以分布于细胞质和细胞核内；为了进一步证明CHOP是由PERK通路介导的，还是由PKR通路介导的？用PERK/PKR抑制剂GSK2606414处理之后检测CHOP变化，结果表明NDV感染通过PKR-eIF2α信号通路，诱导CHOP表达。以上结果表明NDV感染能够激活CHOP和IRE1α信号通路。
（2）CHOP信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了探究CHOP通路对NDV增殖和细胞凋亡影响，用NDV感染、干扰CHOP和外源表达CHOP，Western blot结果表明NDV感染下调表达抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1，激活AKT以及ERK1/2、JNK和p38MAPKs信号通路。siCHOP能够显著抑制NDV病毒蛋白NP表达，同时，细胞上清中的病毒滴度也降低；上调表达抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1，而抑制促凋亡JNK、p38信号通路的激活，进而减少PARP剪切和细胞凋亡；过表达CHOP能够增加病毒蛋白表达，而细胞上清中病毒滴度的变化不明显；CHOP表达可以抑制促存活蛋白AKT激活，减少抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1表达，而显著激活JNK，增加PARP剪切，促进细胞凋亡。以上结果表明CHOP有利于病毒增殖，且通过调控BCL-2家族蛋白，MAPKs和AKT信号通路，促进凋亡。
（3）IRE1α-XBP1信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了研究IRE1α对NDV复制、细胞凋亡的影响，干扰IRE1α后，用Western blot和qRT-PCR方法检测对病毒复制、细胞凋亡的影响。结果表明caspase-3和PARP的剪切减少，明显降低病毒蛋白NP的转录和表达，且下调UPR相关基因EDEM1、ERdj4、p58IPK的转录；过表达IRE1α，caspase-3和PARP的剪切增加，上调ERdj4、p58IPK的转录，增加病毒蛋白NP的转录和表达。为了进一步研究IRE1α是否通过XBP1通路调控病毒复制和细胞凋亡，将XBP1基因进行干扰，发现siXBP1抵抗病毒诱导凋亡，抑制病毒增殖。以上结果证明IRE1α通过调控XBP1s的转录表达，以及上调UPR相关基因EDEM1、ERdj4、p58IPK的转录，促进病毒复制，增强NDV感染诱导宿主细胞的凋亡。
（4）IRE1α-TXNIP信号通路与NDV复制、细胞凋亡关系；为了研究NDV感染对IRE1α-TXNIP信号通路介导细胞凋亡的影响，NDV感染HeLa细胞，Western Blot和IFA检测TXNIP变化情况。结果表明NDV感染通过激活IRE1α，调控TXNIP蛋白表达。干扰和外源表达TXNIP实验结果表明，TXNIP不利于病毒增殖；同时，qRT-PCR检测IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-8，结果表明TXNIP下调细胞因子的转录。以上结果表明，NDV感染可以通过激活IRE1α-TXNIP信号通路，调控病毒复制和宿主细胞凋亡。
（5）NDV感染与JNK信号通路的关系；NDV感染HeLa细胞能够磷酸化激活JNK，使其入核。为了研究NDV感染如何调控JNK信号通路，干扰IRE1和外源表达IRE1α，以及NF-κB抑制剂IKK16处理HeLa细胞，Western blot结果显示siIRE1抑制JNK的磷酸化，而过表达IRE1α促进JNK激活；IKK16处理细胞显著抑制JNK磷酸化；结果表明NDV感染可以通过调控IRE1α和NF-κB信号通路激活JNK。
JNK是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以参与调控炎症反应、细胞增殖、分化和凋亡等生理过程。为进一步研究JNK通路对病毒增殖和凋亡影响，用特异性siRNA干扰JNK和用JNK抑制剂sp600125处理细胞，结果显示siJNK抑制病毒蛋白的转录和表达，也抑制NF-κB信号通路的激活，TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-β的转录显著降低，PARP和caspase-3的剪切减少；与此结果相一致，sp600125处理细胞也抑制病毒蛋白的转录和表达，明显抑制炎性因子的转录，且PARP剪切减少。以上结果表明NDV感染可以通过激活IRE1α/NF-κB-JNK通路，促进细胞凋亡和炎症反应，有利于病毒增殖。
本文中，主要探究了在NDV感染的肿瘤细胞中，有关内质网应激反应介导的相关凋亡。结果显示，NDV可以通过调控或激活UPR诱导的相关转录因子，如CHOP、XBP1s和促凋亡MAPKs信号，诱导细胞凋亡。NDV感染可以通过诱导表达促凋亡蛋白CHOP和激活IRE1α-XBP1s/JNK信号通路介导凋亡。除IRE1α-TXNIP通路之外，这些UPR分支活化有利于NDV增殖。